欖香烯乳對(duì)大腸癌HCT—116細(xì)胞侵襲及miR—155表達(dá)的影響

毛鎮(zhèn)偉 滿昌峰 彭輝勇 范鈺

[摘要]目的觀察欖香烯乳對(duì)人大腸癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響，并探討其可能機(jī)制。方法采用不同濃度的欖香烯乳處理人大腸癌HCT116細(xì)胞后，以劃痕試驗(yàn)方法檢測(cè)癌細(xì)胞遷移能力，以Transwell方法檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲能力，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)癌細(xì)胞miR-155mRNA水平。結(jié)果人大腸癌HCT116細(xì)胞經(jīng)欖香烯乳處理后，遷移和侵襲力均明顯下降，且呈劑量依賴性（P<0.05）。欖香烯乳處理組miR-155mRNA水平明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性。結(jié)論欖香烯乳可降低人大腸癌細(xì)胞侵襲能力，下調(diào)miR-155mRNA表達(dá)是其重要機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞]大腸腫瘤；欖香烯乳；侵襲力；miR-155

[中圖分類號(hào)]R735.3+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1674-4721（2012）12（a）-0007-03

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)大腸癌發(fā)病率逐漸增高，尋找有效的治療藥物和治療手段乃當(dāng)務(wù)之急。欖香烯乳（elemene）是從中藥溫莪術(shù)提取的有效成分之一，臨床應(yīng)用已顯示其具有較廣泛的抗癌譜[1-5]。但是欖香烯乳調(diào)控癌細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制尚不完全清楚。本課題組以大腸癌HCT-116細(xì)胞為模型，探討了欖香烯乳對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲的效應(yīng)，并從microRNA（miRNA）角度探討其分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

欖香烯乳，購(gòu)自華立金港制藥有限公司；人大腸癌細(xì)胞系HCT-116，本院組織細(xì)胞生物庫(kù)凍存；RNA提取試劑TriIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；基底膜膠（Matrigel）購(gòu)自BD公司；RPMI1640、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人大腸癌HCT-116細(xì)胞置于含5%胎牛血清的RPMI-1640液中，在37°CCO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用不同濃度（10、20、40μg/mL）的欖香烯乳處理，以RPMI-1640代替欖香烯乳處理細(xì)胞作為空白對(duì)照組，3復(fù)孔，備測(cè)。

1.2.2癌細(xì)胞遷移檢測(cè) 采用劃痕法檢測(cè)癌細(xì)胞遷移能力，具體步驟參照文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。基本操作步驟如下：（1）先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1.0cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線。（2）同樣方法培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化、計(jì)數(shù)，使用培養(yǎng)基配制成濃度為8×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1mL細(xì)胞懸液，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細(xì)胞鋪滿單層。（3）用100μL槍頭沿培養(yǎng)板底部呈“一”字形劃痕；用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜。（4）棄去培養(yǎng)基，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，用培養(yǎng)基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入1000μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。（5）6孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，拍照。

1.2.3細(xì)胞侵襲檢測(cè) 該試驗(yàn)在Transwell板上進(jìn)行，具體步驟參照文獻(xiàn)[7-8]方法進(jìn)行。倒置顯微鏡（×100）觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)。每張膜中央部分和周圍部分各隨機(jī)取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)穿過(guò)聚碳酸酯膜微孔的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4miR-155mRNA水平檢測(cè) 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。采用Trizol方法抽提細(xì)胞總RNA抽提，采用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-155定量PCR上游引物：5′-CGCGCTTAATGCTAATCGTGA-3′；下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，大小為62bp。內(nèi)參GAPDH上游引物：5-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′；下游引物：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′，大小為115bp。循環(huán)條件及計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得到的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1欖香烯乳對(duì)大腸癌細(xì)胞遷移的影響

采用劃痕法觀察欖香烯乳對(duì)癌細(xì)胞遷移的影響。與對(duì)照組癌細(xì)胞（圖1A）比較，欖香烯乳處理組癌細(xì)胞遷移速度較慢，遷移距離明顯低于空白對(duì)照組（圖1B），后者劃痕兩側(cè)癌細(xì)胞已趨融合。

2.2欖香烯乳對(duì)大腸癌細(xì)胞侵襲的影響

收集經(jīng)欖香烯乳處理的HCT116細(xì)胞，采用Transwell檢測(cè)癌細(xì)胞侵襲情況。對(duì)照組、不同濃度（10、20、40μmol/L）欖香烯乳處理組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞分別為（43.8±1.7）、（31.6±1.6）、（18.5±1.5）和（8.8±1.2）個(gè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示，細(xì)胞侵襲呈濃度依賴性減少（P<0.05）。

2.3欖香烯乳對(duì)大腸癌細(xì)胞miR-155的影響

以欖香烯乳處理大腸癌HCT-116細(xì)胞后，采用熒光實(shí)時(shí)定量CR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，欖香烯乳各處理組miR-155mRNA水平明顯下調(diào)，呈濃度依賴性（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

3討論

遷移性是轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞重要特征之一。在成體組織中大多數(shù)正常細(xì)胞不具有遷移性，而惡性腫瘤細(xì)胞一般具有十分活躍的遷移性。體外培養(yǎng)時(shí)，正常細(xì)胞具有遷移的接觸抑制，因而呈單層生長(zhǎng)；而癌細(xì)胞喪失了遷移的接觸抑制，從而呈多層重疊生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌HCT-116細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移性，而經(jīng)欖香烯乳處理后，細(xì)胞遷移距離明顯縮短。

惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性是侵襲和轉(zhuǎn)移，而這也是惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一。腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程非常復(fù)雜，盡管不同種類腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移特性有所不同，但侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鏈步驟基本相同。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程首先包括腫瘤細(xì)胞的分離脫落（即惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤病灶脫離），然后向周圍組織侵襲，當(dāng)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤分離脫落后，必須穿透原發(fā)腫瘤周圍的宿主結(jié)締組織才能進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，之后通過(guò)血液循環(huán)和淋巴循環(huán)游走到遠(yuǎn)處組織器官，形成繼發(fā)性腫瘤。在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞外基質(zhì)是重要的步驟。在本研究體外侵襲實(shí)驗(yàn)中，觀察到人大腸癌HCT-116細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲能力，經(jīng)欖香烯乳處理后，癌細(xì)胞侵襲能力明顯下降，且呈濃度依賴性（P<0.05）。由此說(shuō)明，欖香烯乳對(duì)大癌細(xì)胞侵襲具有明顯的抑制作用。

MicroRNAs是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的長(zhǎng)為20～24nt單鏈小分子RNA。大量證據(jù)表明，microRNAs的異常表達(dá)與多種人類癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[10]。MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究表明，miR-155過(guò)表達(dá)和多種上皮系統(tǒng)來(lái)源惡性腫瘤的發(fā)生及其惡性生物學(xué)表型密切相關(guān)。在許多實(shí)體瘤如乳腺癌、大腸癌等多種實(shí)體瘤組織或細(xì)胞中高表達(dá)[11-12]，但目前尚不清楚miR-155在大腸癌細(xì)胞侵襲中的可能作用。本研究以欖香烯乳處理大腸癌細(xì)胞后，以蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)MK基因蛋白水平，結(jié)果顯示，欖香烯乳各處理組miR-155水平明顯下調(diào)，且呈濃度依賴性（P<0.05）。因此，筆者推測(cè)欖香烯乳抑制大腸癌細(xì)胞遷移侵襲，可能與下調(diào)miR-155mRNA有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，欖香烯乳可明顯降低大腸癌細(xì)胞侵襲能力，下調(diào)miR-155表達(dá)是其重要機(jī)制之一。

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（收稿日期：2012-10-18 本文編輯：陳 俊）