外源性八肽膽囊收縮素對嗎啡所致SH-SY5Y和PC12細(xì)胞毒的保護(hù)作用

李 冬，孟雁欣，楊勝昌，文 迪，叢 斌，馬春玲

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊050017）

外源性八肽膽囊收縮素對嗎啡所致SH-SY5Y和PC12細(xì)胞毒的保護(hù)作用

李 冬，孟雁欣，楊勝昌，文 迪，叢 斌，馬春玲*

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，河北省法醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北石家莊050017）

目的觀察外源性八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）對嗎啡處理SH-SY5Y及PC12細(xì)胞毒性作用的影響。方法應(yīng)用二甲基噻唑二苯基四噻唑鹽［3-（4，5）-dimethylthiazo（-2-yl）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT］法觀察嗎啡對SH-SY5Y及PC12細(xì)胞毒性作用的劑量和時間依賴關(guān)系，并且觀測外源性CCK-8對嗎啡細(xì)胞毒性作用的影響。結(jié)果①嗎啡在100～10 000μmol/L濃度范圍內(nèi)顯著降低SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的生存率，半數(shù)抑制率分別為2 520μmol/L和680μmol/L；上述作用在孵育48h明顯，隨時間延長逐漸增強；CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯抑制3 000μmol/L嗎啡作用48h后SH-SY5Y細(xì)胞生存率的下降，CCK-8（10-6、10-8和10-10mol/L）可明顯抑制1 000μmol/L嗎啡作用48h后PC12細(xì)胞生存率的下降；②3 000μmol/L和1 000μmol/L嗎啡分別處理SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞48h后，可見細(xì)胞胞體變圓，突觸變短或消失，失去原有的細(xì)胞形態(tài)。CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯改善嗎啡作用后SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的形態(tài)改變。結(jié)論外源性CCK-8可濃度依賴地對抗嗎啡產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用。

受體，膽囊收縮素；嗎啡；法醫(yī)毒理學(xué)

嗎啡成癮被認(rèn)為是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病，長期研究［1］表明其與嗎啡導(dǎo)致的神經(jīng)元毒性密切相關(guān)。嗎啡的神經(jīng)毒性及其機制的研究日漸引起廣泛關(guān)注，有研究［2］表明嗎啡可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，并且在體模型也顯示嗎啡可導(dǎo)致不同腦區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)相應(yīng)的病理學(xué)改變。長期應(yīng)用阿片類物質(zhì)可引起體內(nèi)抗阿片物質(zhì)的釋放來維持體內(nèi)的平衡狀態(tài)，八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8）作為目前已知最強的內(nèi)源性抗阿片肽，已被證實在嗎啡鎮(zhèn)痛耐受和成癮過程中具有重要的拮抗作用［3］。本室以往研究也顯示CCK-8在嗎啡依賴和戒斷中發(fā)揮了重要的作用［4］。本課題在體外培養(yǎng)SH-SY5Y和PC12細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用二甲基噻唑二苯基四噻唑鹽［3-（4，5）-dimethy lthiazo（-2-yl）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT］法觀察了嗎啡細(xì)胞毒性及不同濃度CCK-8對其的影響，為探討嗎啡的神經(jīng)毒性和CCK-8的神經(jīng)保護(hù)作用提供細(xì)胞學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：PC12細(xì)胞系（上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫），SH-SY5Y細(xì)胞系（上海拜力生物科技有限公司）；DMEM F12及RPMI培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（英國PAA公司）；鹽酸嗎啡注射液（沈陽第一制藥廠），CCK-8（美國Sigma公司），MTT（美國Sigma公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），細(xì)胞自動計數(shù)儀（美國Invitrogen公司），Olympus光學(xué)顯微鏡。

1.2 SH-SY5Y以及PC12細(xì)胞的培養(yǎng)：SH-SY5Y細(xì)胞接種于含有10％的胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素的DMEM F12培養(yǎng)基中，PC12細(xì)胞接種于含有10％的胎牛血清、100U/mL青、鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中，37℃下持續(xù)通入5％CO2和95％空氣培養(yǎng)。

SH-SY5Y和PC12細(xì)胞均呈貼壁生長狀態(tài)，50mL培養(yǎng)瓶底貼壁密度達(dá)70％～80％時，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×105/mL密度接種于96孔板，100μL/孔。過夜孵育培養(yǎng)使細(xì)胞進(jìn)入G0期后給予藥物干預(yù)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞生存率：MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。分別于各組作用結(jié)束前4h加入10μL/孔MTT，4h后再加入150μL/孔，10％SDS終止反應(yīng)，孵育過夜，待顆粒溶解后以酶標(biāo)儀（570nm）測定各孔光密度值（optical density，OD）。細(xì)胞生存率=檢測組OD/對照組OD×100％。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 不同濃度嗎啡對細(xì)胞生存率影響：嗎啡工作液依次10倍比稀釋為0.1～10 000μmol/L，作用48h，每個濃度設(shè)立6個副孔。計算其半數(shù)抑制率（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）值，觀測嗎啡作用的濃度依賴性，以篩選嗎啡作用濃度。

1.4.2 嗎啡作用不同時間對細(xì)胞生存率的影響：根據(jù)篩選得到的嗎啡濃度，分別作用不同時間點，3、6、12、24、48、96h，觀測嗎啡作用的時間依賴性。

1.4.3 CCK-8對嗎啡作用的影響：CCK-8依次100倍稀釋為10-6～10-12mol/L，作用48h，觀察單獨CCK-8對SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞生存率的影響。并且在嗎啡作用前15min加入不同濃度的CCK-8，以觀測CCK-8對嗎啡處理2種細(xì)胞生存率的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度嗎啡對SH-SY5Y及PC12細(xì)胞生存率的影響：嗎啡作用于SH-SY5Y和PC12細(xì)胞48h，細(xì)胞生存率隨濃度增加而逐漸下降，顯示出明顯的濃度依賴性。對于SH-SY5Y細(xì)胞，0.1～100μmol/L嗎啡對細(xì)胞生存率無明顯影響（P＞0.05），1 000μmol/L嗎啡作用48h后細(xì)胞生存率降低了24.8％，而10 000μmol/L作用細(xì)胞48h后，細(xì)胞生存率僅為2.2％，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。對于PC12細(xì)胞，0.1～10μmol/L嗎啡對細(xì)胞生存率無明顯影響（P＞0.05），100～

1 000μmol/L嗎啡可濃度依賴地抑制PC12細(xì)胞的生存率，與對照組相比均明顯下降（P＜0.01）（圖1）。同時我們通過計算求得嗎啡對SH-SY5Y及PC12的IC50分別為2 520μmol/L和680μmol/L，因此我們篩選嗎啡濃度分別為3 000μmol/L及1 000μmol/L對SH-SY5Y及PC12細(xì)胞進(jìn)行下一步的實驗。

2.2 嗎啡作用不同時間對SH-SY5Y及PC12細(xì)胞生存率的影響：3 000μmol/L及1 000μmol/L嗎啡分別作用于SH-SY5Y及PC12細(xì)胞3、6、12、24、48、96h。隨著嗎啡作用時間的增加，2種細(xì)胞的生存率逐漸下降，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），顯示出明顯的時間依賴性。見表2。

2.3 CCK-8對嗎啡作用SH-SY5Y及PC12細(xì)胞的影響：單獨10-6、10-8、10-10以及10-12mol/L CCK-8分別作用于SH-SY5Y和PC12細(xì)胞48h，細(xì)胞生存率與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對于SH-SY5Y細(xì)胞，10-6和10-8mol/L的CCK-8可明顯升高3 000μmol/L嗎啡處理SH-SY5Y細(xì)胞48h后的細(xì)胞生存率（P＜0.01），而10-10以及10-12mol/L的CCK-8無明顯作用（P＞0.05）。對于PC12細(xì)胞，10-6、10-8和10-10mol/L的CCK-8可明顯升高1 000μmol/L嗎啡作用48h的細(xì)胞生存率（P＜0.01），而10-12mol/L的CCK-8則無明顯影響（P＞0.05）。見圖3，4。

2.4 嗎啡對SH-SY5Y及PC12細(xì)胞形態(tài)的影響及CCK-8對其的改善作用：3 000μmol/L和1 000μmol/L嗎啡分別處理SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞48h后，可見細(xì)胞胞體變圓，突觸變短或消失，失去原有的細(xì)胞形態(tài)。CCK-8（10-6和10-8mol/L）可明顯改善嗎啡作用后細(xì)胞的形態(tài)改變，可見細(xì)胞胞體長梭形，存在細(xì)長突觸，呈現(xiàn)了較為正常的細(xì)胞形態(tài)（與對照組相比），10-10和10-12mol/L的CCK-8則無明顯作用。見圖5。

3 討論

自從嗎啡被提取純化之后，強大、長效的鎮(zhèn)痛作用使其被廣泛應(yīng)用于臨床，然而嗎啡的神經(jīng)毒性近幾十年才被關(guān)注。雖然對嗎啡鎮(zhèn)痛作用及其機制有被深入研究，但對其神經(jīng)毒性的探討仍留有很多難點、疑點。嗎啡濫用引發(fā)的社會、健康問題日益凸顯，嗎啡的神經(jīng)毒性在其成癮機制中發(fā)揮了什么作用？對神經(jīng)細(xì)胞的影響究竟基于怎樣的分子通路？都有待于我們進(jìn)一步研究。本室以往研究發(fā)現(xiàn)CCK-8可減緩嗎啡依賴并減輕嗎啡戒斷癥狀［4］。CCK-8屬于小分子肽類物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)機能活動，CCK-8通過與其受體結(jié)合發(fā)揮拮抗嗎啡的作用。目前，CCK-8的神經(jīng)保護(hù)作用機制尚不明確，其對嗎啡神經(jīng)毒性的作用尚未見報道。

SH-SY5Y和PC12細(xì)胞株分別來源于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤和大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤，在細(xì)胞形態(tài)、生理、生化等功能上與正常的神經(jīng)細(xì)胞相似，是神經(jīng)細(xì)胞研究比較理想的細(xì)胞模型［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，由于個體耐受性不同嗎啡致死量存在較大差別，嗎啡成癮者對嗎啡有極強的耐受性，可耐受正常量的35～40倍，約70μmol/L，而不發(fā)生中毒，根據(jù)本次研究的結(jié)果，嗎啡成癮者體內(nèi)的嗎啡濃度對神經(jīng)細(xì)胞的生存率已產(chǎn)生影響，達(dá)到細(xì)胞毒水平。本研究發(fā)現(xiàn)：①3 000μmol/L嗎啡作用于SH-SY5Y細(xì)胞48h后可導(dǎo)致其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體變圓，突觸變短或消失。MTT結(jié)果也顯示，嗎啡可濃度和時間依賴地抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生存率，與以往文獻(xiàn)報道一致。SH-SY5Y細(xì)胞主要表達(dá)μ阿片受體。以往研究對嗎啡導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制和凋亡的機制研究較為明確，μ阿片受體在細(xì)胞介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ROS產(chǎn)生、caspase級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。嗎啡可能通過作用于SH-SY5Y細(xì)胞表面的μ阿片體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生［7］，通過氧化還原修飾影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。②1mmol/L嗎啡作用于PC12細(xì)胞48h后可導(dǎo)致其細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)類似于SH-SY5Y細(xì)胞的改變。MTT結(jié)果也同樣顯示，嗎啡可濃度和時間依賴的抑制PC12細(xì)胞的生存率。PC12細(xì)胞表面主要表達(dá)κ受體。以往也有研究報道嗎啡可與κ受體結(jié)合，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶和C-Jun氨基末端激酶信號通路而影響細(xì)胞的活性［8-9］。

然而嗎啡對SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞IC50的不同提示受體類型與嗎啡對細(xì)胞的活性影響的差異可能存在一定的相關(guān)性。已知嗎啡對μ阿片受體的親和力遠(yuǎn)高于κ受體，而本研究得到的結(jié)果卻顯示PC12細(xì)胞對嗎啡細(xì)胞毒性表現(xiàn)出較SH-SY5Y細(xì)胞更高的敏感性，我們推測存在除受體以外多種因素共同參與了嗎啡的神經(jīng)毒性作用。

本室以往研究發(fā)現(xiàn)，外源性CCK-8可減緩嗎啡依賴并減輕嗎啡戒斷癥狀［4］。近期研究發(fā)現(xiàn)CCK-8可濃度依賴的抑制谷氨酸引起的細(xì)胞損傷或死

亡［10］。選擇性CCK2受體拮抗劑L-365，260可以完全阻斷CCK-8類似物藍(lán)肽保護(hù)作用，提示CCK2受體可能介導(dǎo)了CCK-8對抗谷氨酸的毒性作用。也有研究［11］顯示CCK-8、CCK-8類似物藍(lán)肽、CCK-8NS可以通過作用于CCK2受體抑制N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-asportic acid，NMDA）受體介導(dǎo)的谷氨酸對大鼠大腦皮層神經(jīng)元的毒性作用；CCK-8在體內(nèi)及體外均能明顯改善谷氨酸所致的神經(jīng)元病理損害；谷氨酸激活NMDA受體后促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，Ca2+與鈣調(diào)素結(jié)合激活一氧化氮合酶，進(jìn)而生成大量一氧化氮引起細(xì)胞損傷［12］。對培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的研究［13］發(fā)現(xiàn)，膽囊收縮素對NMDA受體激活引起的Ca2+內(nèi)流無影響，但可通過胞內(nèi)某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制Ca2+與鈣調(diào)素的結(jié)合而減少一氧化氮合成，發(fā)揮拮抗谷氨酸的神經(jīng)毒性作用。

本研究發(fā)現(xiàn)CCK-8可濃度依賴地抑制嗎啡誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞和PC12細(xì)胞生存率的下降，改善細(xì)胞形態(tài)。雖然嗎啡神經(jīng)毒性的細(xì)胞機制尚未完全明確，但其最終都是通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖抑制或凋亡。研究［14］發(fā)現(xiàn)，嗎啡可通過對核因子-κB的直接抑制以及降低腫瘤壞死因子-α的表達(dá)和釋放，在體外誘導(dǎo)許多癌細(xì)胞系的凋亡。CCK-8可通過激活腺苷-3'，5-環(huán)化-磷酸-蛋白激酶A通路，抑制蛋白激酶通路進(jìn)而抑制大鼠肺組織及大鼠肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞內(nèi)核因子-κB的活性［15］，或通過其他途徑抑制蛋白激酶C而降低核因子-κB的活性［16］。目前CCK-8發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用機制仍不明確，對于CCK-8是通過影響嗎啡誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制還是細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，仍有待我們進(jìn)一步探索。（本文圖見封二）

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（本文編輯：劉斯靜）

CCK-8 PROTECTSMORPHINE-INDUCED CYTOTOXICITY IN SH-SY5Y AND PC12 CELLS

LIDong，MENG Yanxin，YANG Shengchang，WEN Di，CONG Bin，MA Chunling*Department of Forensic Medicine，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University；
Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China）

Objective To explore the effect of exogenous cholecystokinin octapeptide（CCK-8）on morphine-induced cytotoxicity.M ethods 3-（4，5）-dimethy lthiazo（-2-yl）-3，5-diphenytetrazoliumromide（MTT）assay was used to assess the dose-and time-dependent response of morphine-induced cytotoxicity in SH-SY5Y and PC12 cells，also the effectof CCK-8 onmorphine-induced cytotoxicity was observed.Results ①The concentration of morphine was from 100μmol/L to 10 000μmol/L which reduced the survival rate of SH-SY5Y and PC12 cells significantly.And the half maximal inhibitory concentration was 2 520μmol/L and 680μmol/L respectively，meanwhile this role became obviously after 48h and then gradually increased with time.CCK-8（10-6and 10-8mol/L）could obviously inhibit the effect ofmorphine on the survival rate of SH-SY5Y cells，while CCK-8（10-6，10-8and 10-10mol/L）could obviously inhibit the effectofmorphine on PC12 cells.②After treating SH-SY5Y cells and PC12 cellswith 3 000μmol/L and 1 000μmol/Lmorphine separately for 48 hours，both of the cells lost their normal shape with synapse shorten or lost，CCK-8（10-6and 10-8mol/L）could

receptors，cholecystokinin；morphine；forensic toxicology

R894.2

A

1007-3205（2013）01-0001-04

2012-09-12；

2012-10-22

國家自然科學(xué)基金（30672355，81172900）；河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究重點基礎(chǔ)研究項目（10966911D）

李冬（1984-），女，滿族，河北石家莊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事物質(zhì)成癮研究。

*通訊作者。E-mail：chunlingma@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.01.001

significantly improve cellmorphological alternation induced bymorphine.Conclusion Exogenous CCK-8 could inhibitmorphine-induced cytotoxicity in a concentration-dependentway.