同型半胱氨酸對腺苷脫氨酶試劑交叉污染的分析

馮志剛，徐名烤，修寧寧，歐日花，劉肖瑛，李忠信

(東莞康華醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523080)

同型半胱氨酸對腺苷脫氨酶試劑交叉污染的分析

馮志剛，徐名烤，修寧寧，歐日花，劉肖瑛，李忠信

(東莞康華醫(yī)院檢驗科，廣東東莞523080)

目的探討篩查和確認交叉污染來源的思路，評估對應(yīng)消除措施的效果。方法發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)后緊跟腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)檢測存在交叉污染，通過用兩個可比的生化檢測系統(tǒng)配對分析一組20例患者標本和5例質(zhì)控樣本ADA結(jié)果來篩查交叉污染，分析試劑空白數(shù)據(jù)和實時反應(yīng)曲線數(shù)據(jù)辨別其來源，然后分別采用加強清洗、特殊清洗和調(diào)整檢測順序來消除交叉污染并確認其效果。結(jié)果兩組患者標本ADA差值為7.20±3.20U/L，質(zhì)控樣本差值為6.00±1.73 U/L，P＜0.05存在統(tǒng)計學差異。交叉污染發(fā)生前后，ADA檢測反應(yīng)曲線加入試劑R2后第22點吸光度分別為0.01094±0.00129和0.03544±0.00605，提示ADA試劑R2被污染。將HCY調(diào)整至ADA之后檢測，試劑空白吸光度回復正常，措施有效。結(jié)論合理設(shè)置生化項目檢測順序能夠有效地避免試劑交叉污染的發(fā)生。

交叉污染；腺苷脫氨酶；同型半胱氨酸

目前各級臨床實驗室已廣泛引進國內(nèi)外不同品牌和類型的全自動生化分析儀，其快速、高效、準確、精密的特點，極大地提高了生化檢測的質(zhì)量和效率。其中潛在的交叉污染也是一種不可忽視的現(xiàn)象，防范措施除常用的沖洗之外尚有特氟隆涂層技術(shù)、空氣分隔、惰性液分隔、清洗設(shè)置、超聲混勻、超聲洗滌和項目間隔等方式[1]。有關(guān)交叉污染的發(fā)生已有較多報道[2-5]，但目前尚無統(tǒng)一的標準和方案來對其進行篩查和確認[6]。本文報道發(fā)生在同型半胱氨酸(HCY)試劑與腺苷脫氨酶(ADA)試劑之間的交叉污染，在影響單一的檢測結(jié)果外，更嚴重的是導致ADA試劑穩(wěn)定性不為所知的緩慢變化，藉此提供一種發(fā)現(xiàn)并解決此類問題的思路和做法。

1 材料與方法

1.1 儀器SIEMENS ADVIA 2400全自動生化分析儀。SIEMENS DADE RXL全自動生化分析儀。試劑：浙江寧波美康生物科技有限公司HCY試劑盒(循環(huán)酶法，浙食藥監(jiān)械(準)字2009第2400443號)和ADA試劑盒(酶比色法，浙食藥監(jiān)械(準)字2010第2400646號)。校準品、質(zhì)控品：浙江寧波美康生物科技有限公司提供HCY、ADA配套校準品和質(zhì)控品。標本：2012年10月期間，選取我院住院患者次日空腹，門診患者和健康體檢人群當日，真空采集靜脈血4ml，30min內(nèi)離心分離血清，上機檢測。

1.2 實驗方法

1.2.1 交叉污染的發(fā)現(xiàn)在SIEMENS ADVIA 2400全自動生化分析儀上設(shè)定HCY，CKMB，ADA三個項目順序檢測，因故取消CKMB后出現(xiàn)ADA項目質(zhì)控偏移和患者結(jié)果無法解釋的升高現(xiàn)象，實驗室內(nèi)使用同廠試劑和校準品在SIEMENSDADEDimension RXL生化分析儀上檢測相同質(zhì)控和患者標本，采用配對t檢驗分析結(jié)果。

1.2.2 交叉污染來源的篩查全自動生化分析儀的交叉污染可能由樣本針、攪拌棒、比色杯、試劑針攜帶產(chǎn)生。從上述現(xiàn)象初步懷疑是試劑針交叉污染。收集并分析交叉污染發(fā)生前后ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)做篩查。

1.2.3 交叉污染的確認選取出現(xiàn)交叉污染前200例及交叉污染后20例患者標本ADA檢測情況進行研究，根據(jù)SIEMENS ADVIA 2400全自動生化分析儀提供的反應(yīng)曲線實時監(jiān)測數(shù)據(jù)，整理分析加入試劑1+樣本、加入試劑2后兩個讀數(shù)點吸光度范圍，做統(tǒng)計學分析，找出引起試劑交叉污染的組分。查看試劑說明書，分析可能造成交叉污染的組分。

1.2.4 交叉污染的消除和確認分別使用如下三種方法避免交叉污染，并觀察試劑空白吸光度數(shù)據(jù)的變化來確認其有效性。(1)應(yīng)用ADVIA2400儀器的防污染沖洗功能，設(shè)置ADA試劑R1、R2加樣前后使用去離子水清洗水加強沖洗；(2)設(shè)置ADA試劑R1、R2加樣前后使用Reagent Probe 2特殊清洗；(3)將HCY的檢測順序調(diào)整至ADA之后。

1.3 統(tǒng)計方法使用SPSS14.0統(tǒng)計軟件，患者標本和質(zhì)控樣本ADA結(jié)果使用配對t檢驗。交叉污染發(fā)生前后吸光度數(shù)據(jù)使用t檢驗，P＜0.05具有統(tǒng)計學差別。

2 結(jié)果

2.1 SIEMENS ADVIA 2400和SIEMENS DADE Dimension RXL分別對一組患者標本和質(zhì)控樣本進行檢測的配對t檢驗，結(jié)果見表1?？梢夾DVIA組患者標本及質(zhì)控樣本均高于Dimension組，存在明顯的交叉污染。

表1 ADVIA 2400與Dimension RXL患者標本和質(zhì)控樣本的配對t檢驗

2.2 交叉污染發(fā)生前后試劑空白數(shù)據(jù)對比見表2?？梢钥闯鍪艿轿廴镜腁DA試劑在第7d超出廠商說明書聲稱的有效范圍0.2，無法繼續(xù)使用。

2.3 分析ADVIA 2400全自動生化分析儀的ADA反應(yīng)曲線實時監(jiān)測數(shù)據(jù)，交叉污染發(fā)生后的測試過程中加入試劑1和樣本后第7點吸光度無統(tǒng)計學差異，而加入試劑2后第22點吸光度明顯高于交叉污染發(fā)生前，存在統(tǒng)計學差異(見表3)，提示交叉污染可能來源于試劑2。

表3 交叉污染發(fā)生前后反應(yīng)曲線第7點、第22點吸光度比較

表3 交叉污染發(fā)生前后反應(yīng)曲線第7點、第22點吸光度比較

注：*表示P＜0.05，交叉污染前后加入試劑2后第22點吸光度存在顯著性差異。

加入試劑2后第22點交叉污染前交叉污染后組別n加入試劑1和樣本后第7點200 20 0.01267±0.00099 0.01204±0.00101 0.01094±0.00129 0.03544±0.00605*

查詢廠商說明書，HCY和ADA試劑組分見表4?？梢钥闯鯤CY試劑2成分中含有濃度高達5KU/L的腺苷脫氨酶，通過試劑2針對ADA試劑R2產(chǎn)生交叉污染，除造成患者標本和質(zhì)控樣本結(jié)果偏高外，還引起ADA試劑空白逐漸升高，導致廠商聲稱的一個月開蓋穩(wěn)定期縮短為不到一周。

表4 HCY、ADA試劑盒試劑組分

2.4 將交叉污染發(fā)生前、發(fā)生后、加強清洗、特殊清洗和調(diào)整檢測順序等條件下的ADA試劑每日空白吸光度數(shù)據(jù)繪制圖1。從圖中可以看出加強清洗、特殊清洗不能消除HCY對ADA的試劑交叉污染，將HCY調(diào)整至ADA檢測之后可以達到預期效果。圖中還可明顯看出，HCY、CKMB、ADA的檢測順序條件下比HCY調(diào)整至ADA之后相比，ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)高，可見間隔一個CKMB項目不能完全杜絕HCY對ADA的交叉污染。

3 討論

現(xiàn)在全自動生化分析儀發(fā)展迅猛，不斷涌現(xiàn)的新方法和新項目，更快的檢測速度，不斷增長的試劑倉容量，包含離子選擇電極、酶電極、比色法，比濁法等多種檢測單元，甚至整合有標記技術(shù)原理的免疫模塊，這些先進的技術(shù)促進了儀器檢測水平的提高，同時在實際工作中也帶來了一些新的挑戰(zhàn)和復雜的情況，交叉污染就是其中一個始終值得我們高度重視的問題。而試劑由于其項目種類繁多，成分復雜，儲存及使用條件嚴格，反應(yīng)中所需要的量遠大于樣本量，因此容易發(fā)生交叉污染，且隱蔽性強，難于發(fā)現(xiàn)[7，8]，從而成為臨床實驗室風險管理的重要內(nèi)容[9]。

表2 交叉污染發(fā)生前后ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)

圖1 ADA試劑空白吸光度數(shù)據(jù)隨時間的變化

本文中由于HCY試劑2中含有高達5KU/L濃度的ADA，通過試劑2針交叉污染造成單一測試結(jié)果升高和ADA試劑穩(wěn)定性明顯下降，通過加強清洗，特殊清洗等措施均無法徹底解決，只能將HCY調(diào)整至ADA之后，由此還發(fā)現(xiàn)問題未暴露出來之前兩者中間隔一個項目CKMB，實際上也存在一定程度的交叉污染。一般來講，試劑間造成交叉污染有如下原因：(1)一種試劑中含有另一個項目的目標分析物；(2)一種試劑中含有另一種試劑的成分；(3)一種試劑的某種成分作為另一種試劑反應(yīng)時的中間產(chǎn)物，參與反應(yīng)；(4)一種試劑與標本產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物與另一種試劑與標本發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物相類似；(5)一種試劑的酸堿度對另一種試劑的酸堿度產(chǎn)生大的影響從而對反應(yīng)有干擾。一些可能發(fā)生交叉污染的情況在很多全自動生化分析儀已由廠商預先設(shè)定或為檢驗工作者廣泛應(yīng)用：(1)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(IFCC)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(IFCC)試劑中含有高活力乳酸脫氫酶,可能會對血清乳酸脫氫酶的測定帶來干擾；堿性磷酸酶( IFCC)、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、二氧化碳(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)等多種試劑中含有鎂離子，可能會對血清鎂測定帶來干擾；膽堿酯酶(碘化丁酰硫代膽堿)、膽固醇、葡萄糖(氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)等試劑使用磷酸緩沖液，可能會對無機磷的測定帶來干擾；甘油經(jīng)常用作試劑中酶的保護劑，因此這些試劑可能影響甘油三酯的測定。(2)肌酸激酶、肌酸激酶同工酶試劑中含有葡萄糖成分,其檢測步驟中包含葡萄糖己糖激酶(HK)反應(yīng)過程,因此可能對葡萄糖尤其對己糖激酶法測定帶來嚴重干擾。(3)鎂離子測定試劑(Calmagite)中含有EGTA成分,為Ca2+絡(luò)合劑,可能對Ca2+的測定帶來干擾。(4)基于過氧化物工具酶Trinder反應(yīng)系統(tǒng)的項目不能排列在一起[10]。

目前，對于交叉污染尚無完整、標準的方案可供應(yīng)用。CLSI推出的指南EP10-A2“Preliminary Evaluation of Quantitative Clinical Laboratory Methods”文件中采用低中高3個濃度的樣本以特定的順序重復檢測3批，計算樣本間交叉污染率。林蓮英等[11]研究表明這個方案簡便結(jié)果可靠，適于實際工作中使用。本文從利用患者樣本和質(zhì)控在兩個可比的檢測系統(tǒng)上結(jié)果的差別，試劑空白的變化，實時反應(yīng)曲線的吸光度數(shù)據(jù)等方面來進行交叉污染的篩查和來源識別，采取相應(yīng)的消除措施后再對其有效性加以確認，提供了一種具有針對性分析的思路。

臨床工作中應(yīng)該從以下幾個方面防范試劑交叉污染的發(fā)生。當生化分析儀清洗能力下降或者內(nèi)部存在大量殘留污垢時，常規(guī)清洗無法有效地消除交叉污染，所以應(yīng)該規(guī)范地執(zhí)行儀器的維護保養(yǎng)，定期校準儀器的性能。新項目或者新試劑引入設(shè)置的時候[12]，要參照說明書中的反應(yīng)原理、試劑組成成分、保存和使用條件，合理編排檢測順序，避免交叉污染，減少項目的時候也要注意類似的問題[13]。實際工作中同一標本內(nèi)的檢測順序可以按照優(yōu)化的設(shè)定執(zhí)行，還要注意標本間項目的銜接、急診標本的插入、試劑用空導致檢測順序的改變等各種少見情況[14]。此外，對于全自動免疫分析儀的項目例如乙肝表面抗原和乙肝表面抗體，乙肝e抗原和乙肝e抗體檢測之間也可能存在試劑交叉污染，因此檢驗工作者應(yīng)該全面深刻地認識交叉污染的危害，熟悉儀器項目性能，善于應(yīng)用發(fā)散思維，預先采用各種防范措施，從而保證檢測結(jié)果的準確可靠。

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Assay of reagent carryover of homocysteine to adenosine deaminase

FENG Zhigang,XU Mingkao,XIU Ningning,et al.Department of Clinical Laboratory,Dongguan Kanghua Hospital,Guangdong Dongguan 523080,China

Objective To investigate the method of screening and confirming carryover and to assess the effect of corresponding means to eliminate it.Methods Carryover took place when ADA was analysed after HCY in clinical chemistry automatic analyzer.ADA concentrations in serum of 20 patients and 5 control materials were measured on two set of clinical chemistry systems to screen carryover.Reagent blank data and reaction curve monitor data were checked to find out the source of carrywer.Extra rinse,special rinse and arrangement of assays order were used to eliminate reagent carryover and the effects were observed.Results Differences of ADA concentration in patients were 7.20±3.20U/L and 6.00±1.73 U/L for those of control materials,showing statistical signification as P＜0.05.With occurrence of ADA reagent 2 carryover,the absorbance data at the 22nd point of ADA reaction monitor curve were 0.03544±0.00605 against normal 0.01094±0.00129.When HCY was set after ADA,data of reagent blank of ADA recur normal.Conclusion Proper arrangement order of clinical chemistry assays can avoid reagent carryover.

Carryover;Adenosine deaminase;Homocysteine

R446.11+2

A

1674-1129(2013)03-226-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.009

馮志剛,1978年7月出生，男，漢族，山西省寧武縣人，碩士，主管技師，主要研究方向為臨床生化和分子生物學.