人皮膚成纖維細胞體外轉染Brg1基因的實驗研究

屈 悅 鄧辰亮 萬偉東 茅廣宇 丁 志 楊 松 林 鄭江紅

人皮膚成纖維細胞體外轉染Brg1基因的實驗研究

屈 悅 鄧辰亮 萬偉東 茅廣宇 丁 志 楊 松 林 鄭江紅

目的探討重組Brg1基因轉染人皮膚成纖維細胞的可行性，以及轉染對細胞增殖和活性的影響。方法體外重組Brg1基因，借助真核表達載體系統(tǒng)，轉入體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞；通過流式細胞儀檢測報告基因表達，并確定細胞轉染效率；應用Realtime PCR比較轉染前后Brg1 mRNA的表達；MTT法檢測Brg1基因對細胞增殖能力的影響。結果Brg1基因轉染后，（73.0±6.7）%的被轉染細胞表達報告基因；Brg1 mRNA在轉染組、轉染空載體組、未轉染組細胞中的表達分別為（6.23±1.18）、（1.11±0.22）和（1.52±0.12），轉染組Brg1 mRNA相對表達量較未轉染組及轉染空載體組明顯增高（P＜0.01）；細胞的增殖能力在Brg1基因轉染前后無顯著差異。結論人皮膚成纖維細胞可作為Brg1轉染的靶細胞，轉染Brg1基因對人成纖維細胞的增殖能力無顯著影響。

染色質重構復合物核心催化亞基轉染人皮膚成纖維細胞誘導性多潛能干細胞

2010年，Singhal等[1-2]發(fā)現(xiàn)染色質重構復合物核心催化亞基（Brahma-related gene 1，Brg1）參與ATP介導的染色質重塑過程，與蛋白質Baf155和Ini1聯(lián)合可大大提高體細胞重編程為iPS細胞的效率。大量研究顯示，Brg1能與多種蛋白質結合并相互作用，參與DNA復制和修復、轉錄調節(jié)、基因表達調節(jié)、基因重組等過程，在細胞的增殖、分化、衰老和凋亡中發(fā)揮重要作用[3-8]，因此Brg1具有非常重要的應用意義。本實驗旨在探討重組Brg1基因轉染人皮膚成纖維細胞的可行性，以及轉染Brg1基因對細胞增殖的影響，為進一步探究iPS細胞對人成纖維細胞的影響提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

0.25%DispaseⅡ酶、DMEM培養(yǎng)基、T4DNA連接酶、Trizol試劑盒（Gibco公司，美國）；TaKa逆轉錄試劑盒、Taq酶PCR試劑盒、DNA Marker、6×loading buffer、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，日本）；膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α、DNA連接試劑盒、質粒小量提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）；PCR引物、pcDNA3.1-GFP載體、Brg1 cDNA片段（生工生物工程股份有限公司）；限制性內切酶EcoRI、XbaI（大連寶生物工程有限公司）；脂質體Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，美國）；胎牛血清FBS（Hyclone公司，美國）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma，美國）；二甲基亞砜（Sigma，美國）。

1.2 表達載體的構建

1.2.1 引物設計及目的基因PCR擴增

根據(jù)人Brg1基因組序列，設計上下游引物。為保證干擾效果，在引物上、下游分別引入EcoRI和XbaI內切酶酶切位點（下劃線處）。Full length-F：5'-CGGAATTCAAGGGAGCAGGCTCAGAGTG3'，F(xiàn)ull length-R：5'-GCTTCAGATGACGGAAGGAAGAGCCGA-3'。引物合成后，利用購得的Brg1 cDNA按Taq酶試劑盒操作說明進行PCR擴增反應。目的基因長度為3 500 bp。將產物凝膠電泳分離后，切膠回收、純化Brg1片段。

1.2.2 Brg1真核表達載體構建與鑒定

將PCR純化產物與pcDNA3.1-GFP質粒分別用限制性內切酶EcoRI和XbaI進行雙酶切后，凝膠電泳、純化回收酶切產物。經(jīng)T4DNA連接酶16℃過夜連接后，轉化DH5感受態(tài)細胞，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，挑取陽性克隆擴增后，提取轉染成功的pcDNA3.1-Brg1-GFP質粒進行雙酶切后，電泳鑒定。

1.3 細胞提取

標本來源于上海第六人民醫(yī)院整形外科門診患者的上瞼皮膚，獲患者知情同意。于無菌條件下切取，置于含有青霉素（100 000 U/L）和鏈霉素（100 mg/L）的PBS中，浸泡30 min后移至培養(yǎng)皿，剔除皮下組織，剪成小條狀，以0.25%DispaseⅡ酶4℃過夜消化。揭下表皮，將分離的真皮剪碎至1～2 mm3大小，37℃搖床消化3 h，150目濾網(wǎng)收集過濾液，1 500 r/min離心10 min，收集細胞，按2×104cells/cm2接種于培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 h后更換培養(yǎng)液，以后3 d換一次液，第3天鏡下觀察成纖維細胞游離出，并能順利傳代視為培養(yǎng)成功。

1.4 細胞轉染與分組

轉染前一天，將第3代細胞按2×105個/孔接種于2個培養(yǎng)皿中，待細胞融合度達80%時準備轉染質粒。分別取2組無血清DMEM培養(yǎng)液240 μL與10 μL脂質體Lipofectamine 2000混合，另取2組240 μL DMEM培養(yǎng)液分別與10 μL（100 pmol）pcDNA3.1-GFP和10 μL（100 pmol）pcDNA3.1-Brg1-GFP質?；靹?，5 min后分別將脂質體和兩種質粒液合并，室溫下放置20 min；吸掉培養(yǎng)皿內培養(yǎng)液，以每管1.5 mL加無血清DMEM培養(yǎng)基，再分別加入2組質粒轉染液，37℃培養(yǎng)5 h后，棄轉染液，換10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞分組：未轉染正常組、轉染空載體pcDNA3.1-GFP組和pcDNA3.1-Brg1-GFP轉染組。

1.5 細胞轉染效率的檢測

當轉染細胞生長48 h時，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況；收集、離心并調整細胞數(shù)量至1×106（體積1 mL細胞懸液），同樣收集未轉染細胞以及空載體細胞至同樣體積與濃度，進行流式細胞儀分析和檢測。

1.6 Realtime PCR檢測Brg1基因的表達

當細胞轉染2 d后，分別收集未轉染正常組、轉染空載體pcDNA3.1-GFP和Brg1轉染組的細胞，用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計定量后，按TaKaLa逆轉錄試劑盒操作說明行逆轉錄反應。根據(jù)人Brg1基因序列，設計上、下游引物序列。Brg1-F：5'-TTGACTACAGGCTCGTGGCT-3'，Brg1-R：5'-GGTATCATGAGTACCCGGTT-3'。將3組產物及合成的引物行Realtime PCR反應，具體步驟按SYBR Premix Ex TaqTM使用說明書操作。

1.7 MTT法檢測Brg1轉染對細胞增殖能力的影響

通過標準曲線確定每孔細胞數(shù)為1×105個。轉染24 h后，分別收集未轉染正常細胞、轉染空載體pcDNA3.1-GFP和Brg1轉染組的細胞，每組5個復孔，以每孔1×105細胞濃度接種于96孔板。在避光環(huán)境下，取每組第1個復孔加入濃度為5 mg/mL的MTT液20 μL，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，置于恒溫振蕩箱內振蕩10 min，使結晶充分溶解。用酶標儀測定各組在490 nm波長處的吸光度值（OD值），每組的其余復孔分別于轉染后第2、3、4、5天重復上述操作步驟。

以各組細胞培養(yǎng)的天數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制曲線。

1.8 統(tǒng)計分析

SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Brg1基因表達載體構建的檢測

重組pcDNA3.1-Brg1-GFP質粒用EcoRI和XbaI雙酶切后電泳，在同一泳道中出現(xiàn)2條DNA帶，1條帶在5 000～7 500 bp之間，與酶切后的空載體pcDNA3.1-GFP DNA鏈長度相符，確定為質粒DNA帶；另1條帶在2 500～5 000 bp之間，與目的基因片段大小相符；空載體pcDNA3.1-GFP經(jīng)相同雙酶切后電泳僅見5 000～7 500 bp之間的1個條帶（圖1）。這表明已成功構建了重組表達載體。

圖1pcDNA3.1-Brg1-GFP質粒的酶切鑒定結果Fig.1The restriction endonuclease result of pcDNA3.1-Brg1-GFP

2.2 細胞轉染效率檢測結果

2.2.1 綠色熒光蛋白的表達

成纖維細胞被轉染48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可見細胞內綠色熒光蛋白的表達（圖2）。

圖2Brg1轉染后綠色熒光蛋白的表達Fig.2The expression of green fluorescent protein after Brg1 transfection

2.2.2 流式細胞儀分析

成纖維細胞被轉染48 h后，（73.0±6.7）%的被轉染細胞表達報告基因熒光（圖3）。

圖3Brg1轉染后流式細胞儀分析Fig.3The flow cytometric analysis after Brg1 transfection

2.3Realtime PCR檢測Brg1基因表達

轉染24 h后，Realtime PCR檢測到Brg1基因在轉染組、轉染空載體組、未轉染組細胞中的表達分別為（6.23±1.18）、（1.11±0.22）和（1.52±0.12），轉染組Brg1 mRNA相對表達量較未轉染組和轉染空載體組明顯增高（n＝5，P＜0.01），而未轉染組和轉染空載體組比較，無統(tǒng)計學差異（n＝5，P＞0.05）（圖4）。

圖4Brg1 mRNA在轉染組、轉染空載體組、未轉染組細胞中的表達情況Fig.4Brg1 mRNA expression in transfected cell group, empty-vector cell group or un-transfected cell group

2.4MTT法檢測Brg1轉染對細胞增殖能力的影響

MTT法顯示，隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖數(shù)量增加，在細胞培養(yǎng)的第2～4天，細胞增殖速度最快，第4天后，細胞增殖能力趨向穩(wěn)定。細胞的增殖能力在Brg1轉染組、轉染空載體組、未轉染組無顯著性差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5Brg1轉染組、轉染空載體組和未轉染組細胞增殖能力Fig.5The cell proliferation curve of Brg1 transfected cell group,empty-vector cell group or un-transfected cell group

3 討論

Yarnanaka等[9]應用逆轉錄病毒將小鼠成纖維母細胞重編程為具有多分化潛能的干細胞，命名為誘導性多潛能干細胞（Induced pluripotent stem cells，iPS細胞）。該技術使得將同一個體易獲得的體細胞變成具有多向分化潛能的干細胞成為可能，避免了異體移植產生的免疫排斥反應，也避免了長期困擾胚胎干細胞研究的倫理問題[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，Brg1參與ATP介導的染色質重塑過程，與蛋白質Baf155和Ini1聯(lián)合可將體細胞重編程為iPS細胞的效率提高至4.5%，遠高于以往的文獻報道，大大加快了成體細胞重編程為iPS細胞的研究進程。

Brg1作為SWI/SNF復合物的一種核心酶，在多種細胞因子的協(xié)調作用及復雜機制下，可與多種蛋白質結合并相互作用，參與DNA復制和修復、轉錄調節(jié)、基因表達調節(jié)等過程，影響細胞的增殖、分化、癌變、衰老和凋亡。但是目前關于Brg1基因作用的研究主要集中在血管發(fā)生、內皮細胞的保護及胚胎器官發(fā)生等方面，Brg1轉染人體成纖維細胞的研究還未曾有文獻報道。本實驗為探明Brg1轉染人體皮膚成纖維細胞的可行性，及對轉染后細胞增殖和活性的影響，具有重要的現(xiàn)實意義，也為進一步研究iPS細胞及其他方面的研究奠定重要的基礎。

本實驗中，重組的Brg1基因轉入體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞后，轉染的Brg1轉錄因子在成纖維細胞中的有效表達，是判斷Brg1基因轉染成功與否的關鍵。我們將流式細胞儀觀察與相對精確的Realtime PCR方法相結合，結果發(fā)現(xiàn)（73.0±6.7）%的細胞表達報告基因，而且轉染后的細胞Brg1 mRNA表達明顯高于對照細胞，提示Brg1基因已成功轉入。

本實驗結果提示，當人皮膚成纖維細胞被導入Brg1基因后，與未轉染Brg1基因對照組相比，細胞的增殖活性未見顯著性差異。雖然Brg1作為染色質重塑復合物的核心酶，可以促進細胞的增殖與分化，但決定細胞增殖的因素很多，且需要其他細胞因子的共同參與，如Brg1與蛋白質Baf155和Ini1聯(lián)合可大大提高體細胞重編程為iPS細胞的效率[1]。同時Brg1是一種重要的抑癌基因，此前已有大量研究證實，Brgl基因在卵巢癌、宮頸癌、神經(jīng)膠質瘤及結腸癌細胞中高表達，而在肺癌組織及其它多種腫瘤細胞系中表達下調或缺失[12-16]。細胞惡變是一個多因素、多環(huán)節(jié)、多階段、復雜漸進的過程，可能與啟動子異常甲基化、基因突變及其轉錄激活功能異常等因素有關；同時，Brg1在不同來源組織間表達及作用的差異可能反映其具有組織/細胞特異性。

綜上所述，本實驗證實了人體皮膚成纖維細胞可作為Brg1轉染的靶細胞，轉染組Brg1基因后對人成纖維細胞的增殖及活性未見顯著影響。但體外和體內實驗結果是否完全一致，Brg1轉染靶細胞后在體內的具體情況如何，還有待于進一步研究。

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Transfection of Recombinant Brg1 Gene into Human Skin Fibroblasts in Vitro

QU Yue,DENG Chenliang,WAN Weidong,MAO Guangyu,DING Zhi,YANG Songlin,ZHENG Jianghong.Department of Plastic Surgery,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200233,China.Corresponding author:ZHENG Jianghong(E-mail:zjhsh68@sohu.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of transfecting recombinant Brg1 into human skin fibroblasts and to investigate the impact on cell proliferation rate and activity.MethodsRecombinant human Brg1 was transfected into skin fibroblasts by the karyocyte expressive vector.The cell transfection efficiency was determined through testing reported gene expression by flow cytometry;The expression of Brg1 mRNA before and after transfection was quantified by Realtime PCR; MTT was used to detect cell proliferation before and after transfection.ResultsThe cell transfection efficiency of human skin fibroblasts was nearly(73.0±6.7)%;The relative expression level of Brg1 mRNA in transfected cell group,empty-vector cell group or un-transfected cell group were respectively 6.23±1.18,1.11±0.22 and 1.52±0.12.The level of mRNA in transfected cell group was significantly higher compared with either un-transfected cell group or empty-vector cell group(P＜0.01); The proliferation abilities had no significant difference before and after transfection.ConclusionThe human skin fibroblasts can be used as the target cells of Brg1 gene transfection,which has no significant impact on fibroblast proliferation.

Brahma-related gene 1;Transfection;Human skin fibroblasts;Induced pluripotent stem cells

Q786

A

1673－0364（2013）02－0089－04

2013年1月14日；

2013年3月3日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.007

國家自然科學基金（81000837）。

200233上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第六人民醫(yī)院整形外科。

鄭江紅（E-mail：zjhsh68@sohu.com）。