鋅離子促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其纖黏連蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

畢曉云 黃 舒 郭 杰 陳晶礪 陳小堅(jiān) 丁 麗 陳 津 郭子寬

鋅離子促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其纖黏連蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

畢曉云 黃 舒 郭 杰 陳晶礪 陳小堅(jiān) 丁 麗 陳 津 郭子寬

目的探索適宜的鋅離子濃度，以促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSC）在無血清培養(yǎng)基中的黏附和增殖。方法將人骨髓MSC培養(yǎng)于含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的α-MEM中，體系中加入不同濃度硫酸鋅。培養(yǎng)72 h后，MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定490 nm光密度值，觀察細(xì)胞增殖狀態(tài)。蛋白印跡雜交比較含鋅離子（1×10-5M）培養(yǎng)體系與未加鋅離子培養(yǎng)體系兩組細(xì)胞纖黏連蛋白含量的差異。結(jié)果MTT結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，鋅離子促進(jìn)人骨髓MSC增殖，作用呈濃度依賴性，適宜濃度為1×10-5M；蛋白印跡實(shí)驗(yàn)表明，在該濃度刺激下細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，纖黏連蛋白表達(dá)量顯著升高。結(jié)論鋅離子可作為人無血清培養(yǎng)基中的一個(gè)成分，可提高人骨髓MSC的貼壁生長能力。

間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)體系鋅離子纖黏連蛋白

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是骨髓中的非造血干細(xì)胞，具備向成骨、成軟骨和成脂肪細(xì)胞分化的能力，具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用[1-5]。因此，MSC是組織工程化骨和軟骨構(gòu)建中重要的種子細(xì)胞，而且由于MSC具有促進(jìn)造血重建和抑制移植物抗宿主反應(yīng)的功能，在造血細(xì)胞移植中也具有廣泛的應(yīng)用前景[6-10]。MSC具有體外貼壁生長特性，利用細(xì)胞的貼壁性能，人們已經(jīng)從人、犬、兔、大鼠、雞、綿羊、山羊、豬和牛骨髓中，成功分離出MSC[11-14]。將人或牛等其他動(dòng)物骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，貼壁的細(xì)胞群體中含有間充質(zhì)干/祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞等。因培養(yǎng)體系中血清濃度較低，且經(jīng)過嚴(yán)格篩選，體系中未添加內(nèi)皮細(xì)胞生長因子或其他細(xì)胞因子，不利于內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞增殖。因此，隨著培養(yǎng)傳代進(jìn)行，MSC成為貼壁層中的主要成分（90%以上）。然而，為進(jìn)行以MSC為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療，人們通常獲取少量的骨髓、臍帶、脂肪或胎盤組織，在體外通過貼壁生長篩選并擴(kuò)增MSC，達(dá)到所需量時(shí)，收獲MSC用于治療?？梢?，體外擴(kuò)增MSC是實(shí)施MSC細(xì)胞治療的關(guān)鍵步驟之一。因此，體外培養(yǎng)不但是擴(kuò)增也是純化MSC的有效手段。

通常，人們利用經(jīng)篩選、適于人MSC生長的牛血清，作為細(xì)胞增殖的主要刺激物，體外培養(yǎng)擴(kuò)增MSC。然而，研究表明，在培養(yǎng)過程中，MSC可以吞噬培養(yǎng)體系中的牛蛋白，使異種蛋白內(nèi)在化，每108個(gè)MSC中牛蛋白含量達(dá)到10～30 mg[15]?？梢?，使用牛血清培養(yǎng)人MSC用于細(xì)胞治療，將使患者暴露于罹患人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)中，也可能因移植MSC死亡而釋放出牛蛋白，引起機(jī)體免疫反應(yīng)，造成血清病或其他免疫性疾病。此外，每批次血清的活性是不同的，各批次間收獲的細(xì)胞穩(wěn)定性存在差異。因此，利用一種無動(dòng)物血清成分的培養(yǎng)基，培養(yǎng)擴(kuò)增MSC，對(duì)治療的安全性和有效性，都是十分必要的。

纖黏連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是血清中促進(jìn)細(xì)胞貼壁生長的主要成分。由于FN分子量較大，純化的FN不易保存，在無血清培養(yǎng)體系中添加FN，不是理想的措施。通常，人MSC在含血清的α-MEM培養(yǎng)基中生長良好[16]。然而，與其他常見的低血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較，α-MEM中不含鋅離子。因此，本研究探討在無血清培養(yǎng)條件下，添加鋅離子對(duì)人骨髓MSC增殖和合成FN的影響，以明確無血清體系中添加鋅離子的可能性，以及適當(dāng)?shù)挠昧俊?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為本研究室保存，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Invitrogen公司）。硫酸鋅（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，Sigma公司）。MTT、人胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉（Sigma公司）。小鼠抗人FN抗體、小鼠抗人GAPDH抗體、辣根酶標(biāo)記的兔抗小鼠抗體和化學(xué)發(fā)光底物（Santa Cruz公司）。胎牛血清（Hyclone公司）。

1.2 方法

1.2.1 人間充質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)

取凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（第3～5代）3份，37℃快速融化后滴加于α-MEM培養(yǎng)基。1 200 r/min離心5 min后收獲細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)活細(xì)胞數(shù)，按照10 000 cells/cm2底面積接種于100 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)體系為含10%FCS的α-MEM。37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h后，胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，PBS洗滌2次。將細(xì)胞懸浮于α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，體系中加入5 μg/mL胰島素、5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和30 nM的亞硒酸鈉。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106cells/mL，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

配制含5 μg/mL胰島素、5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和30 nM的亞硒酸鈉的α-MEM（稱為ITS體系），加入終濃度分別為0、10-7M、5×10-7M、10-6M、5×10-6M、10-5M、5×10-5M、10-4M的硫酸鋅。在上述體系中加入MSC，使其終濃度為30 000 cells/mL。將細(xì)胞懸液移至96孔板，每孔100 μL，每組12孔。置于37℃、5%CO2下培養(yǎng)72 h，每孔加入MTT（1 mg/mL）10 μL，末排孔作為空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，去除培養(yǎng)上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL。酶聯(lián)免疫儀上測(cè)定每孔光密度值，測(cè)定波長為490 nm。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別采用3個(gè)骨髓標(biāo)本來源的細(xì)胞。

1.2.3 蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)

利用ITS體系培養(yǎng)人骨髓MSC，以減少細(xì)胞內(nèi)固有的FN含量，傳代1次后收集細(xì)胞用于蛋白印跡雜交實(shí)驗(yàn)。簡言之，將收獲細(xì)胞重懸于上述體系，體系中含或不含終濃度為10-5M的硫酸鋅。將細(xì)胞按照5×105個(gè)/皿的濃度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h。胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解后，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照每道20 μg上樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。含1%BSA的TBS緩沖液封閉過夜后，加入抗FN或抗GAPDH抗體，室溫反應(yīng)2 h。經(jīng)洗滌后，加入抗小鼠抗體，室溫反應(yīng)30 min，化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

MTT實(shí)驗(yàn)所得光密度值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

人骨髓MSC在只含胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉的α-MEM中培養(yǎng)，細(xì)胞呈纖細(xì)條狀，培養(yǎng)24 h內(nèi)尤其明顯。結(jié)果提示，可能由于體系中缺乏黏附分子，人骨髓MSC貼壁性差。鑒于適于CHO工程細(xì)胞培養(yǎng)的低血清或無血清條件培養(yǎng)基中常含有10-5M的鋅離子，因此向ITS體系中加入終濃度為10-5M的硫酸鋅，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。結(jié)果表明，與未添加鋅離子組比較，細(xì)胞貼壁性較好，細(xì)胞活性也有改善，提示鋅離子可能促進(jìn)人骨髓MSC的增殖與貼壁（圖1）。

圖1 不同體系培養(yǎng)的人骨髓MSC典型的形態(tài)特征Fig.1 Morphological features of human bone marrow MSCs in different media

2.2 鋅離子促進(jìn)MSC增殖

在ITS體系中加入不同濃度硫酸鋅，72 h后測(cè)定細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，濃度為10-7M和5×10-7M時(shí)，OD490與對(duì)照組無顯著差別（P＞0.05）；濃度在10-6M至10-5M之間時(shí)，OD490逐漸升高，以10-5M組最為明顯，顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），濃度高于10-5M時(shí)細(xì)胞活性反而逐漸下降。結(jié)果提示，在無血清培養(yǎng)條件下，一定濃度的硫酸鋅可促進(jìn)人骨髓MSC的增殖（圖2）。

圖2 不同濃度的硫酸鋅對(duì)MSC增殖的影響Fig.2 The growth-promoting effect of different concentrations of zinc sulfate on human MSCs

2.3 硫酸鋅促進(jìn)MSC合成FN

為進(jìn)一步觀察ITS體系中加入鋅離子后，MSC易于貼壁生長的機(jī)制，選擇添加適宜濃度（10-5M）的鋅離子，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行蛋白印記雜交分析細(xì)胞FN含量。結(jié)果顯示，經(jīng)鋅離子刺激后，人骨髓MSC內(nèi)FN含量明顯增加（圖3），提示無血清培養(yǎng)條件下加入鋅離子，細(xì)胞合成FN增加是其貼壁性增強(qiáng)的原因之一。

圖3Western－Blot檢測(cè)MSCs中FN的表達(dá)Fig.3 The cellular content of FN of each sample by Western－Blot

3 討論

MSC具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，作為細(xì)胞藥物，已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，用于治療兒童移植物抗宿主病[17]。此外，有關(guān)MSC的多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期階段，有望用于肝臟纖維化、克隆氏病和心肌梗死等多種疾病的治療。然而，人骨髓或臍帶MSC培養(yǎng)體系中的牛血清，一直是MSC臨床應(yīng)用的隱患。為此，人們一直在尋找動(dòng)物血清替代物，用于人MSC的培養(yǎng)[18]。有人用血清替代物Ultroser G替代牛血清，培養(yǎng)人骨髓MSC，獲得了較好的效果。然而，Ultroser G本身就含有牛血清成分，這種方式的替代并不能從根本上解決異體蛋白污染問題[19]。之后，有人提出應(yīng)用人血小板濃縮液替代牛血清，經(jīng)過凍融激活或其他途徑活化血小板，使之釋放多種細(xì)胞增殖相關(guān)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子等，MSC在該體系中增殖良好[20-24]。但是，血小板供者的健康狀態(tài)、傳染病的傳播，以及能否保障所獲得MSC的批次間穩(wěn)定性等，都是必須考慮的問題。因此，研制化學(xué)成分清晰明確、無動(dòng)物血清成分、無人血制品成分來源的MSC培養(yǎng)基，是十分必要的。

商品化的α-MEM是常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在添加血清后適用于人骨髓或臍帶MSC的培養(yǎng)[25]。但在無血清條件下或在低血清條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，α-MEM可能不是較好的選擇，研究者更多選擇MCB-301等基礎(chǔ)培養(yǎng)基。與這些培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)，α-MEM不含鋅離子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鋅離子能明顯促進(jìn)人骨髓MSC的增殖，且在含有簡單成分情況下，加入鋅離子能明顯改善細(xì)胞貼壁狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)和活性均趨于含血清培養(yǎng)的MSC。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鋅離子能顯著增強(qiáng)MSC合成FN。FN是一種血清中的主要黏附分子，是貼壁細(xì)胞增殖過程中防脫壁的關(guān)鍵成分。因此，在設(shè)計(jì)MSC無血清培養(yǎng)基配方時(shí)，適量添加鋅離子是必要的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示，10-5M是一個(gè)可供選擇的濃度。

鋅離子促進(jìn)MSC增殖和FN合成的機(jī)制尚不清楚。細(xì)胞內(nèi)多種鋅指蛋白（如Slug），是維系細(xì)胞生理功能的必要分子，其活性和含量直接影響多種核轉(zhuǎn)錄因子的活性[26]。此外，F(xiàn)N分子中與細(xì)胞黏附有關(guān)的片段，也是以與鋅結(jié)合的形式存在[27]?？梢?，鋅離子參與細(xì)胞多方面的代謝，其作用也呈現(xiàn)多樣性，有關(guān)促M(fèi)SC貼壁生長的機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究探索。

[1]Aggarw nal S,Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell response[J].Blood,2005,105(4)：1815-1822.

[2]Potian JA,Aviv H,Ponzio NM,et al.Veto-like activity of mesenchymal stem cells：functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens[J].J Immunol,2003, 171(7)：3426-3434.

[3]Beyth S,Borovsk Z,Mevorach D,et al.Human mesenchymal stem cells alter antigen presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness[J].Blood,2005,105(5)：2214-2219.

[4]Guo ZK,Li H,Li XS,et al.In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells[J].Stem Cells,2006,24(4)：992-1000.

[5]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potentiall of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999;284 (5411)：143-147

[6]王恒湘,郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞在組織再生應(yīng)用中的諸多問題[J].組織工程與重建外科,2008,4(5)：241-245.

[7]Tolar J,Le Blanc K,Keating A,et al.Concise review：hitting the right spot with mesenchymal stromal cells[J].Stem Cells,2010,28 (8)：1446-1455.

[8]Han D,Liu J,Xue M,et al.Clinical analysis of the treatment of spinocerebellar ataxia and multiple system atrophy-cerebellar type with umbilical cord mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy, 2011,13(8)：913-917.

[9]Wang H,Wang Z,Xue M,et al.Co-transfusion of haplo-identical hematopoietic and mesenchymal stromal cells to treat a patient with severe aplastic[J].Cytotherapy,2010,12(4)：563-565.

[10]Le Blanc K,Frassoni F,Ball L,et al.Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant,severe,acute graft-versus-host disease：a phase II study[J].Lancet,2008,371(9624)：1579-1586.

[11]邊素艷,郭子寬,葉平,等.四種哺乳類動(dòng)物骨實(shí)質(zhì)中存在間充質(zhì)干細(xì)胞[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2010,18(1)：151-154.

[12]張薇薇,郭子寬.間充質(zhì)干細(xì)胞臨床試驗(yàn)中的問題及其解決策略[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2007,15(4)：901-904.

[13]Jin JD,Wang HX,Xiao FJ,et al.A novel rich source o f human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow samples [J].Biochem Biophys Res Commun,2008,376(1)：191-195.

[14]李棟,沈柏均,侯懷水,等.兔骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞的生物學(xué)特征及其對(duì)不同生長因子的反應(yīng)[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2006,14(5)：964-968.

[15]Spees JL,Gregory CA,Singh H,et al.Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy[J].Mol Ther,2004,9(8)：747-756.

[16]Salehinejad P,Alitheen NB,Nematollahi-Mahani SN,et al.Effect of culture media on expansion properties of human umbilical cord matrix-derived mesenchymal cells[J].Cytotherapy,2012,14(8)：948-953.

[17]Battiwalla M,Hematti P.Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation[J].Cytotherapy,2009,11(5)：503-515.

[18]Meuleman N,Tondreau T,Delforge A,et al.Human marrow mesenchymal stem cell culture：serum-free medium allows better expansion than classical alpha-MEM medium[J].Eur J Haematol, 2006,76(2)：309-316.

[19]Korhonen M.Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions：no breakthroughs yet[J].Eur J Haematol, 2006,78(1)：167.

[20]Schallmoser K,Bartmann C,Rohde E,et al.Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells[J].Transfusion,2007,47 (8)：1436-1446.

[21]Müller I,Kordowich S,Holzwarth C,et al.Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM[J].Cytotherapy, 2006,8(5)：437-444.

[22]Reinisch A,Bartmann C,Rohde E,et al.Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application[J].Regen Med,2007,2(4)：371-382.

[23]Bernardo ME,Avanzini MA,Perotti C,et al.Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches：further insights in the search for a fetal calf serum substitute[J].J Cell Physiol,2007,211(1)：121-130.

[24]Lange C,Cakiroglu F,Spiess AN,et al.Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serumfree medium for transplantation and regenerative medicine[J].J Cell Physiol,2007,213(1)：18-26.

[25]Liu CH,Wu ML,Hwang SM.Optimization of serum free medium for cord blood mesenchymal stem cells[J].Biochem Engineering J,2007,33(1)：1-9.

[26]Shirley SH,Hudson LG,He J,et al.The skinny on Slug[J].Mol Carcinog,2010,49(10)：851-861.

[27]Askari JA,Thornton DJ,Humphries JD,et al.The alternatively spliced type III connecting segment of fibronectin is a zincbinding module[J].Matrix Biol,2007,26(6)：485-493.

Zinc Ion Promotes the Proliferation and Fibronectin Expression of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

BI Xiaoyun1,HUANG Shu1,GUO Jie1,CHEN Jingli1,CHEN Xiaojian1,DING Li2,CHEN Jin2,GUO Zikuan2.1 Guangzhou Hospital of Developmental District,Guangzhou 510730,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:Huang Shu(E－mail:huang_shu@tom.com).

ObjectiveTo investigate the appropriate concentration of zinc ion in the serum-free medium promoting the attachment and proliferation of human mesenchymal stem cells(MSCs).MethodsHuman bone marrow MSCs were maintained in α-MEM containing insulin,transferrin and selenite sodium,with or without graded concentrations of zinc ion. Optical density at 490 nm was detected with MTT assay to evaluate the proliferation status of MSCs cultured for 72 hours. MSCs were cultured in the presence of zinc ion(1×10-5M)for 72 hours,and the cellular content of fibronectin was detected by western blotting and compared with that of MSCs cultured without zinc ion.ResultsMTT assay showed that zinc ion within a range of concentrations promoted human MSC growth in a dose-dependent manner.MSCs cultured with zinc ion(1× 10-5M)for 72 hours was significantly higher than that of the counterparts without zinc ion.Furthermore,after stimulation in the presence of 1×10-5M zinc ion for 72 hours,the cellular content of fibronectin was greatly higher than that of MSCs in the other concentrations of zinc ion.ConclusionZinc ion could be served as one of the compositions in the serum-free medium to promote the attachment and proliferation of human bone marrow MSCs.

Mesenchymal stem cells;Serum-free medium;Zinc ion;Fibronectin

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）02－0081－04

2012年12月29日；

2013年2月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.005

國家自然科學(xué)基金（30971068）；國家863項(xiàng)目（2011AA020101）；廣州開發(fā)區(qū)科技局課題（2009Q-P081）。

510730廣東省廣州市廣州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)醫(yī)院（畢曉云，黃舒，郭杰，陳晶勵(lì)，陳小堅(jiān)）；100850北京市軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究室（丁麗，陳津，郭子寬）。

黃舒（E－mail：huang_shu@tom.com）。