局部缺血對面神經(jīng)損傷后雪旺細胞增殖的影響

王志興 歐陽火牛 程志華 郭智霖

局部缺血對面神經(jīng)損傷后雪旺細胞增殖的影響

王志興 歐陽火牛 程志華 郭智霖

目的探討局部缺血對面神經(jīng)損傷后雪旺細胞增殖的影響，為臨床治療顱底骨折伴發(fā)面神經(jīng)損傷提供新的思路。方法75只SD雄性大鼠，分為對照組（30只）、實驗組（30只）及空白組（15只）。對照組給予左側(cè)面神經(jīng)單純壓榨性損傷；實驗組給予左側(cè)面神經(jīng)相同的壓榨性損傷后，顯微鏡下剝除神經(jīng)外膜周圍血管；空白組為假手術(shù)組。其中25只于術(shù)后3 d、7 d和21 d進行行為學觀察及電生理檢測，另外50只于術(shù)后3 d、5 d和7 d采集面神經(jīng)標本，S-100抗體標記雪旺細胞，行免疫組化染色分析。結(jié)果電生理檢測及行為學分析顯示：空白組無面癱表現(xiàn)，實驗組與對照組均出現(xiàn)面癱表現(xiàn)。隨著時間延長，兩組面癱癥狀均有恢復，但實驗組恢復速度明顯緩慢；免疫組化顯示：術(shù)后3 d、5 d和7 d空白組雪旺細胞改變無明顯差異。術(shù)后3 d實驗組及對照組雪旺細胞均開始增殖，術(shù)后5 d兩組達到增殖高峰，術(shù)后7 d實驗組雪旺細胞開始明顯減少，對照組無明顯改變。結(jié)論與單純面神經(jīng)損傷比較，損傷伴缺血可明顯導致?lián)p傷處雪旺細胞的增殖減少，阻礙面神經(jīng)的修復。

大鼠面神經(jīng)損傷缺血增殖

面神經(jīng)屬于周圍神經(jīng)，損傷后，其遠端發(fā)生華勒氏變性，而近端的軸突形成新的軸芽。損傷遠端變性的軸突及髓鞘由雪旺細胞吞噬，同時形成Bungner′s帶，并為軸芽的生長提供合適的環(huán)境，這一過程在神經(jīng)損傷修復中具有重要作用[1-3]。近年來，對雪旺細胞的增殖和功能的研究開展較多[4]，但損傷伴缺血對修復影響的研究較少，而損傷伴缺血是顱底骨折伴發(fā)面神經(jīng)損傷的重要原因[5]。我們通過大鼠行為學觀察、電生理檢測及免疫組化染色等方法，研究損傷伴缺血對面神經(jīng)損傷處雪旺細胞增殖的影響，為臨床治療面神經(jīng)損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

75只SD雄性大鼠（上海第九人民醫(yī)院實驗動物中心提供），體質(zhì)量203～258 g，平均240 g。將其隨機分為損傷伴缺血組（實驗組，30只），單純損傷組（對照組，30只）和空白組（15只），進行雙側(cè)面部的自身對照。

1.2 損傷模型的建立

大鼠腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)消毒、備皮，取右側(cè)臥位，常規(guī)乙醇消毒鋪無菌洞巾后，沿耳下1 cm處橫向切開皮膚及皮下筋膜，切口長2 cm，在外耳道軟骨前緣后，沿外耳道軟骨前緣附近解剖出面神經(jīng)主干，并向尾側(cè)鈍性分離至外耳道軟骨后緣，完全暴露面神經(jīng)。手術(shù)組于面神經(jīng)出莖乳孔1 mm處用血管阻斷夾持續(xù)夾持3 min，然后手術(shù)顯微鏡下剝除神經(jīng)表面血管，對照組僅在面神經(jīng)出莖乳孔1 mm處用血管阻斷夾持續(xù)夾持3 min，空白組暴露面神經(jīng)后不作任何處理；徹底止血，逐層關(guān)閉術(shù)區(qū)。術(shù)后給予青霉素局部外用2 d，預防感染。

1.3 大體行為學觀察

大鼠在正常情況下，鼻端朝前，位于正中，觸須在活動時對稱擺動，角膜反射靈敏，可完全閉眼。

術(shù)后分別于3 d、7 d和21 d觀察大鼠的瞬目反射、觸須運動和鼻尖位置，并進行評估[6]。

角膜反射（Corneal Reflex，CR）：用2 mL注射器裝18G針頭，距大鼠眼睛2 cm處，瞬間向眼內(nèi)吹入空氣，觀察大鼠眼瞼活動及閉合情況。①雙側(cè)無明顯差異為0分；②患側(cè)較對側(cè)閉合延遲為1分；③患側(cè)眼瞼不能閉合為2分。

30 sec內(nèi)動物雙側(cè)的觸須活動（Tentacles Activities，TA）。①雙側(cè)觸須活動無明顯差異為0分；②患側(cè)觸須活動較對側(cè)減弱為1分；③患側(cè)觸須活動消失為2分。

觀察大鼠鼻尖位置（Nose Position，NP）。①鼻尖居中為0分；②鼻尖偏向?qū)?cè)為1分。

評分：總分≥3時，動物存在面神經(jīng)麻痹。

1.4 電生理檢測

術(shù)后分別于3 d、7 d和21 d對大鼠面神經(jīng)進行電生理檢測，檢測采用Medelec Synergy T2生理記錄儀（Oxford Instruments公司）。檢測時，大鼠全麻并固定，暴露面神經(jīng)總干損傷部位周圍約10 mm，將刺激電極與神經(jīng)干近心端充分接觸，記錄電極插入口輪匝肌約3～5 mm，兩極距離為10 mm。刺激方式為方波刺激，波寬1 ms，從0 mV開始增大刺激強度，直至出現(xiàn)最大反應波幅為止。測定口輪匝肌復合動作電位的最大波幅（Maximum Amplitude，MA）和潛伏期。

1.5 免疫組織化學

術(shù)后3 d、5 d和7 d取材，將取出的面神經(jīng)置于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，免疫組織化學染色，S-100標記雪旺細胞，Imagepro軟件進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有計數(shù)資料以（均數(shù)±標準差）表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 面神經(jīng)功能評估

實驗組術(shù)后3 d左側(cè)角膜反射消失，觸須無活動，鼻尖向右側(cè)歪斜；術(shù)后7 d有4只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，5只觸須活動部分恢復，但閉眼不全，所有大鼠鼻尖歪斜無恢復；術(shù)后21 d有1只大鼠角膜反射完全恢復，5只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，2只觸須活動完全恢復，4只觸須活動部分恢復，但閉眼不全，所有大鼠鼻尖歪斜無恢復。

對照組術(shù)后3 d左側(cè)角膜反射消失，觸須無活動，鼻尖向右側(cè)歪斜；術(shù)后7 d有6只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，但閉眼不全，6只觸須活動部分恢復，2只鼻尖恢復居中；術(shù)后21 d有3只大鼠角膜反射完全恢復，6只大鼠出現(xiàn)輕微角膜反射，6只觸須活動完全恢復，3只觸須活動部分恢復，但閉眼不全，4只鼻尖恢復居中。

空白組均無面癱表現(xiàn)。

實驗組和對照組面神經(jīng)功能隨時間延長而逐漸恢復。但實驗組恢復速度較對照組緩慢（表1）。

2.2 電生理檢測

對照組及實驗組隨時間延長，口輪匝肌復合動作電位最大波幅和潛伏期逐漸接近空白組水平；組間兩兩比較，實驗組及對照組術(shù)后3 d、7 d和21 d口輪匝肌復合動作電位最大波幅均低于空白組，潛伏期長于空白組（P＜0.05）；實驗組術(shù)后3 d、7 d和21 d口輪匝肌復合動作電位最大波幅低于對照組，潛伏期長于對照組（P＜0.05），差異明顯（表2）。

2.3 組織學觀察

2.3.1 HE染色

術(shù)后第3天，實驗組及對照組軸突均出現(xiàn)明顯腫脹扭曲，實驗組腫脹更為明顯，呈臘腸樣，基底膜腔腫脹，呈串珠狀?？瞻捉M面神經(jīng)纖維排列緊密規(guī)則，軸突明顯，髓鞘無腫脹及退變（圖1）。

術(shù)后第5天，實驗組軸突腫脹加劇，部分崩解消失，髓鞘不連續(xù)或已消失成空泡狀，對照組神經(jīng)纖維情況與實驗組相似，但變性明顯較實驗組輕（圖2）。

術(shù)后第7天，實驗組大量神經(jīng)纖維崩解壞死，神經(jīng)結(jié)構(gòu)紊亂，部分神經(jīng)內(nèi)膜連續(xù)性好，遺留神經(jīng)纖維壞死輪廓。對照組腫脹消退，逐漸恢復正常（圖3）。

2.3.2 S-100蛋白免疫組織化學染色

術(shù)后第3天，S-100累積光密度（IOD）值分別為：實驗組（0.317±0.004），對照組（0.317±0.008），空白組（0.316±0.005），三組間無明顯差異（圖4）。

術(shù)后第5天，實驗組（0.581±0.002），對照組（0.633±0.008），空白組（0.317±0.002）。實驗組和對照組均高于空白組，而對照組則高于實驗組，差異明顯（圖5）。

術(shù)后第7天，實驗組（0.385±0.001），對照組（0.635±0.003），空白組（0.316±0.007），數(shù)據(jù)顯示實驗組和對照組均高于空白組，對照組則高于實驗組。結(jié)果有統(tǒng)計學差異（圖6）。

術(shù)后3 d、5 d和7 d空白組雪旺細胞改變無明顯統(tǒng)計學差異。術(shù)后3 d，實驗組及對照組雪旺細胞均開始增殖；術(shù)后5 d，兩組達到增殖高峰；術(shù)后7 d實驗組雪旺細胞開始明顯減少，對照組則維持峰值（圖7）。

表1 各組術(shù)后3 d、7 d和21 d面神經(jīng)功能不同分度的大鼠數(shù)目Table1 The degree of facial nerve function at 3,7,21 days after operation

表2 口輪匝肌復合動作電位最大波幅和潛伏期(x+s)Table2 The maximum amplitude and latency of Orbicularis oris muscle compound action potential(x+s)

圖1 術(shù)后3 d HE染色（400×）Fig.1 HE staining at 3 day after operation(400×)

圖2 術(shù)后5 d HE染色（400×）Fig.2 HE staining at 5 day after operation(400×)

圖3 術(shù)后7 d HE染色（400×）Fig.3 HE staining at 7 day after operation(400×)

圖4 術(shù)后3 d S-100表達情況（400×）Fig.4 S-100 expression at 3 day after operation(400×)

圖5 術(shù)后5 d S-100表達情況（400×）Fig.5 S-100 expression at 5 day after operation(400×)

圖6 術(shù)后7 d S-100表達情況（400×）Fig.6 S-100 expression at 7 day after operation(400×)

圖7 各組S-100變化趨勢Fig.7 Change trend of S-100

3 討論

近年來，外傷性面神經(jīng)損傷的患者逐年增加，外傷性面神經(jīng)損傷可導致嚴重面癱，給患者造成極大的生理和心理負擔。顱面復合外傷導致面神經(jīng)損傷，大體可分外力直接損傷和間接損傷，后者尤以顱底骨折伴發(fā)面癱為最典型代表。從解剖學上看，面神經(jīng)營養(yǎng)血管位于外膜內(nèi)，分支形成微動脈，并透過神經(jīng)束膜在神經(jīng)束內(nèi)構(gòu)成毛細血管[7]，當顱底骨折時，面神經(jīng)管內(nèi)的面神經(jīng)受到骨折碎片卡壓，局部缺血，神經(jīng)發(fā)生水腫，導致管內(nèi)壓增高，升高的壓力加重血管壓迫，造成神經(jīng)嚴重缺血，神經(jīng)功能喪失。

面神經(jīng)屬于外周神經(jīng)，其損傷后的修復和再生涉及一系列的細胞和分子生物學的改變。損傷后，受損部位近心端軸突膜封閉，防止軸漿持續(xù)外溢，大量Ca2+內(nèi)流，并誘導受損軸突轉(zhuǎn)為再生狀態(tài)[8]；遠心端發(fā)生華勒氏變性，軸索和髓鞘變性壞死，形成碎片；局部雪旺細胞活化增生，在吞噬碎片的同時，釋放巨噬細胞趨化因子和神經(jīng)生長因子、細胞外基質(zhì)和表面黏著分子等，誘導大量巨噬細胞聚集并移除軸突和髓鞘破損碎片。同時，雪旺細胞增生，形成Bungner′s帶，為近端軸突再生進入遠端提供合適的環(huán)境；增生的雪旺細胞分泌神經(jīng)生長因子、睫狀神經(jīng)生長因子、軸突生長因子、層黏連蛋白、纖連蛋白等，促進近端軸突的再生[9]。由此可見，在整個神經(jīng)損傷再生過程中，雪旺細胞是非常重要的。大量研究證實，在神經(jīng)損傷早期，抑制雪旺細胞的增殖會明顯阻礙神經(jīng)的修復。但雪旺細胞逆向分化、增生、吞噬和分泌是一個耗能過程。我們前期的實驗已經(jīng)證實，在神經(jīng)損傷的早期，局部血流量增加，到晚期局部血流量才恢復到正常[10]。Hoke等[1]認為，血流量的增加是因局部華勒氏變性和細胞增殖而出現(xiàn)，是神經(jīng)再生的重要過程，充足的血供是神經(jīng)再生的必要條件。

本實驗成功構(gòu)建了面神經(jīng)損傷伴缺血及面神經(jīng)單純損傷的對比模型。通過行為學觀察及電生理檢測發(fā)現(xiàn)，損傷伴缺血和單純損傷都會損害面神經(jīng)，造成面癱。隨著時間的延長，兩組面神經(jīng)功能都在逐漸恢復，但是損傷伴缺血組面神經(jīng)恢復速度緩慢。

免疫組織化學染色觀察發(fā)現(xiàn)，單純損傷組術(shù)后3 d S-100陽性率并無明顯增加，術(shù)后5 d S-100陽性率明顯增加，術(shù)后7 d S-100陽性率較第5天無明顯增高。這與經(jīng)典華勒變性過程中雪旺細胞的增殖一致。大量相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷后48 h內(nèi)，雪旺細胞開始大量增殖，4 d后達到高峰。損傷伴缺血組術(shù)后3 d S-100陽性率無明顯增加，術(shù)后5 d S-100陽性率顯著增加，但較單純損傷組低，而術(shù)后7 d S-100陽性率明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)損傷后的華勒氏變性及再生過程中，雪旺細胞代謝明顯增強，對能量的需求大量增加。而華勒氏變性過程中，局部缺血會導致雪旺細胞的能量供給發(fā)生障礙，導致雪旺細胞去分化及增殖緩慢，Bungner′s帶形成延遲[11-12]。提示損傷伴缺血組雪旺細胞增殖異常及功能恢復緩慢的原因，可能是由于局部缺血導致雪旺細胞能量供給障礙，從而導致雪旺細胞去分化及增殖緩慢，Bungner′s帶形成延遲，進一步延緩了神經(jīng)功能的恢復。缺血影響雪旺細胞去分化及增殖的具體機制還有待于進一步的研究。

[1]Hoke A,Brushart T.Introduction to special issue：challenges and opportunities for regeneration in the peripheral nervous system [J].Exp Neurol,2010,223(1)：1-4.

[2]Zhang M,Yannas IV.Peripheral nerve regeneration[J].Adv Biochem Eng Biotechnol,2005,94：67-89.

[3]Webber C,Zochodne D.The nerve regenerative microenvironment：early behavior and partnership of axons and Schwann cells[J]. Exp Neurol,2010,223(1)：51-59.

[4]Dubovy P.Wallerian degeneration and peripheral nerve conditions for both axonal regeneration and neuropathic pain induction[J]. Ann Anat,2011,193(4)：267-275.

[5]Holland GR.Experimental trigeminal nerve injury[J].Crit Rev Oral Biol Med,1996,7(3)：237-258.

[6]王海波,馮紅云,樊兆民,等.I型單純皰疹病毒致小鼠面神經(jīng)麻痹的實驗性研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2006,41(1)：13-16.

[7]鐘世鎮(zhèn).臨床應用解剖學[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,1998,764-771.

[8]Shim S,Ming GL.Roles of channels and receptors in the growth cone during PNS axonal regeneration[J].Exp Neurol,2010,223 (1)：38-44.

[9]Rotshenker S.Wallerian degeneration：the innate-immune response to traumatic nerve injury[J].J Neuroinflammation, 2011,8：109.

[10]沈晨,郭智霖,歐陽火牛.兔面神經(jīng)外傷性損傷后恢復的實驗研究[J].組織工程與重建外科,2009,5(3)：150-152.

[11]FosterJM.Enzymaticstudiesofmitochondriaandother constituents oflobster and squid nerve fibres[J].J Neurochem, 1956,1(1)：84-90.

[12]Greengard P,Brink F,Colowick SP.Some relationships between actionpotential,oxygen consumption,and coenzyme content in degenerating peripheral nerves[J].J Cell Comp Physiol,1954,44 (3)：395-410.

The Impact of Ischemic on the Proliferation of Schwann Cells after Facial Nerve Injury

WANG Zhixing,OUYANG Huoniu,CHENG Zhihua,GUO Zhilin.Neurosurgical Department,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:GUO Zhilin(E-mail:gzlysr@126.com).

ObjectiveTo observe the proliferation of Schwann cells after facial nerve injury associated with ischemia and to find the new insight for the clinical treatment of skull base fractures with facial nerve injury.MethodsSeventy-five male SD rats were divided into 3 groups：control group(n=30),experimental group(n=30)and blank group(n=15).Left facial nerve trunks were selected in 3 groups.The control group accepted crush injury only;the experimental group accepted crush injury and stripped of blood vessels around epineurium under microscope;the blank group served as sham group.Twenty-five rats received behavioral observation and electrophysiological testing 3,7 and 21 days after the operation;The remaining 50 rats were killed 3,5 and 7 days after operation respectively,the obtained specimens were stained by S-100,and observed by immunohistochemical staining analysis.ResultsElectrophysiological testing and behavioral analysis showed no facial paralysis performance in blank group;The experimental and control group showed facial paralysis performance,and with the prolongation of time the two groups have a recovery performance.However,the recovery rate of the experimental group was significantly slower.Immunohistochemistry showed the Schwann cells had no significant change among 3,5 and 7 days after operation in blank group;The Schwann cells of the experimental and control group began to proliferate 3 days the operation, the two groups reached the peak of proliferation 5 days the operation;The Schwann cells significantly reduced in experimental group 7 days the operation,while no significant change was observed in control group.ConclusionCrush associated with ischemia could reduce the proliferation of Schwann cells and hinder the recovery of facial nerve.

Rat;Facial nerve;Injury;Ischemia;Proliferation

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）02－0093－06

2013年1月8日；

2013年3月16日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.008

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院神經(jīng)外科。

郭智霖（Email：gzlysr@126.com）。