脫細(xì)胞真皮基質(zhì)預(yù)制人工皮瓣的血管化研究

周顯玉 劉 菲 顧 釧 羅旭松 汪 希 楊 群 楊 軍

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)預(yù)制人工皮瓣的血管化研究

周顯玉 劉 菲 顧 釧 羅旭松 汪 希 楊 群 楊 軍

目的ADM聯(lián)合自體表皮構(gòu)建人工皮瓣模型，探討人工皮瓣血管化所需時(shí)間。方法利用F344雄性大鼠構(gòu)建人工皮瓣模型，分別在術(shù)后第3、7、14、21和28天取材，HE染色、CD31+免疫組化進(jìn)行血管化檢測(cè)，術(shù)后7 d進(jìn)行大鼠人工皮瓣模型微血管造影。結(jié)果術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)人工皮瓣均成活良好，無(wú)感染或壞死；HE染色及CD31+免疫組化顯示，血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，除第21、28天血管數(shù)量無(wú)顯著性差異外（P＞0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)之間血管數(shù)量均有顯著性差異（P＜0.05）；微血管造影顯示，去除ADM的人工皮瓣血管數(shù)量明顯少于ADM去除前。結(jié)論脫細(xì)胞真皮基質(zhì)聯(lián)合帶知名血管的筋膜、自體表皮可以成功預(yù)制人工皮瓣。術(shù)后第3天人工皮瓣開始出現(xiàn)血管化跡象，第7天左右與筋膜組織建立相對(duì)可靠的血運(yùn)，第21天左右基本完成血管化過(guò)程。

脫細(xì)胞真皮基質(zhì)血管化自體表皮

創(chuàng)面修復(fù)是整復(fù)外科的重要問(wèn)題，對(duì)于創(chuàng)基血供差或伴有重要神經(jīng)、血管、骨外露的深度創(chuàng)面，移植的皮片無(wú)法成活，需采用各類皮瓣予以修復(fù)。但是，對(duì)于某些大面積燒傷、全身幾乎已無(wú)皮瓣供區(qū)的患者，創(chuàng)面的覆蓋成為難題[1]。為解決皮瓣供區(qū)來(lái)源短缺的問(wèn)題，近年來(lái)利用復(fù)合皮膚移植，即真皮替代物與自體皮片復(fù)合移植覆蓋深部組織缺損暴露的創(chuàng)面，取得了較好的臨床效果[2]。

但是，由于真皮替代物在本質(zhì)上屬于膠原組織，缺乏血供，移植到較深的創(chuàng)面或血供缺乏部位，較難獲得良好血供，使得臨床應(yīng)用受到較大限制。因此，我們構(gòu)建脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（Acellular dermal matrix，ADM）聯(lián)合自體表皮人工皮瓣模型，研究人工皮瓣血管化所需的時(shí)間，為今后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

23只F344雄性大鼠（本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），體質(zhì)量（250±20）g。10 cm×12 cm J1型網(wǎng)狀脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（北京桀亞萊福生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；CD31+羊抗鼠一抗（Abcam公司）；兔抗羊二抗（Dako公司）；DAB顯色液（Dako公司）；BaSO4粉末（Sigma公司）。ECLIPSE 90i顯微鏡（Nikon公司），石蠟切片機(jī)（Thermo公司），X線機(jī)（美國(guó)Carestream公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建ADM聯(lián)合自體表皮人工皮瓣模型

大鼠吸入性氣體全身麻醉。右側(cè)腹股溝區(qū)設(shè)計(jì)2.5 cm×4.0 cm的術(shù)區(qū)，沿設(shè)計(jì)線切開皮膚組織至筋膜層，離斷形成游離皮片，生理鹽水紗布保存。同時(shí)，切取同樣面積大小的ADM材料，覆蓋于暴露的筋膜組織創(chuàng)面上，4-0絲線間斷縫合固定。將全厚皮片修薄，去除真皮組織，剩下的大張表皮組織回植于ADM上，4-0絲線間斷縫合，敷料加壓包扎（圖1）。

圖1ADM聯(lián)合自體表皮預(yù)制人工皮瓣模型Fig.1Artificial skin flap model fabricated with ADM and autologous epidermis

1.2.2 人工皮瓣的大體觀察

隨機(jī)選擇人工皮瓣模型大鼠2只，在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)分別觀察人工皮瓣的成活及毛發(fā)生長(zhǎng)情況。

1.2.3 HE染色及CD31+免疫組化檢測(cè)

人工皮瓣模型分別在術(shù)后第3、7、14、21和28天取材，5組各4只大鼠，取材時(shí)切至ADM下的筋膜層。石蠟切片，HE染色，CD31+免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中免疫組化一抗試劑濃度為1∶200，熱修復(fù)法暴露血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性抗原。每組含不同切片4張，鏡下觀察10個(gè)不同視野，分別計(jì)數(shù)血管樣結(jié)構(gòu)，采用SPSS19.0軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。

1.2.4 人工皮瓣微血管造影

大體結(jié)果表明，人工皮瓣模型成功建立的最快時(shí)間是術(shù)后第7天。選擇大鼠1只，根據(jù)上述方法構(gòu)建ADM聯(lián)合自體表皮人工皮瓣模型，術(shù)后第7天行人工皮瓣微血管造影。吸入性氣體全身麻醉，應(yīng)用改良的大鼠腹主動(dòng)脈插管造影技術(shù)，經(jīng)下腹部橫行切口開腹，暴露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，動(dòng)脈夾夾閉腹主動(dòng)脈，22號(hào)靜脈留置針插管，同時(shí)下腔靜脈近端結(jié)扎，遠(yuǎn)端24號(hào)靜脈留置針造瘺引流，穿刺成功后松開動(dòng)脈夾，30%BaSO4溶液主動(dòng)脈插管灌注，保持每分鐘注射1 mL BaSO4溶液，直至大鼠死亡[3]。大鼠尸體4℃冰箱過(guò)夜后，沿腹股溝區(qū)游離包括相應(yīng)的腹壁淺血管在內(nèi)的右側(cè)腹股溝筋膜瓣，X線攝片。

2 結(jié)果

2.1 人工皮瓣的大體形態(tài)評(píng)估

術(shù)后第3天清晰可見(jiàn)表皮組織下白色的ADM材料；第7天表皮組織血運(yùn)豐富，充血，創(chuàng)緣見(jiàn)死痂；第14天創(chuàng)緣死痂脫落，表皮充血逐漸消退，皮膚顏色趨于正常；第21天人工皮瓣表面光滑，血運(yùn)佳，形態(tài)好；第28天創(chuàng)面完全愈合，顏色正常，皮瓣存活好。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面無(wú)明顯破潰、感染或ADM暴露，第21至第28天創(chuàng)面見(jiàn)明顯毛發(fā)生長(zhǎng)（圖2）。

圖2 人工皮瓣術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)大體觀Fig.2 Gross observation of artificial skin flap at each time postoperatively

2.2 人工皮瓣毛細(xì)血管密度評(píng)估

第3、7及14天ADM位于表皮層與筋膜層之間，界限明顯，表皮層逐漸由厚變薄，細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量及排列由紊亂逐漸趨于正常，ADM層膠原排列由整齊有序到局部分解，出現(xiàn)裂隙，排列不規(guī)則、紊亂。第3天見(jiàn)多量血管穿過(guò)ADM網(wǎng)孔向上垂直長(zhǎng)入，ADM膠原內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)在第7天達(dá)到高峰。ADM材料周圍血管逐漸增多，并可見(jiàn)少量微血管結(jié)構(gòu)長(zhǎng)入ADM膠原內(nèi)。第21和28天ADM與表皮層、筋膜組織層界限模糊，表皮細(xì)胞層進(jìn)一步變薄，ADM層膠原組織結(jié)構(gòu)紊亂，裂隙明顯，局部可見(jiàn)毛囊生成，血管數(shù)量明顯增多（圖3）。

HE染色血管計(jì)數(shù)顯示，血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量逐漸增多，第7天開始顯著增加。第21和28天無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余均差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

圖4HE染色術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量Fig.4Capillary density at each time postoperatively by HE staining

2.3 人工皮瓣毛細(xì)血管密度的CD31+免疫組化

CD31+免疫組化染色顯示，血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多，伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖5）。

血管計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量逐漸增多，術(shù)后第7天顯著增加，第21和28天血管計(jì)數(shù)無(wú)顯著性差異外（P＞0.05），其余均有顯著性差異（P＜0.05）（圖6）。

2.4 人工皮瓣的微血管造影觀察

術(shù)后第7天大鼠30%BaSO4溶液活體腹主動(dòng)脈灌注，見(jiàn)下腔靜脈造瘺留置管回流的BaSO4溶液和股血管及其分支。體外游離的人工皮瓣見(jiàn)表皮下ADM組織和充斥BaSO4溶液的白色股血管及腹壁淺血管，X線攝片見(jiàn)其腹壁淺血管及其豐富的分支，去除表皮下的ADM材料后再行X線造影，見(jiàn)人工皮瓣的血管數(shù)量明顯減少（圖7）。

圖5 人工皮瓣毛細(xì)血管密度CD31+免疫組化鏡下觀察（200×）Fig.5 Capillary density of artificial skin by CD31+immunohistochemistry(200×)

圖6 CD31+免疫組化染色各時(shí)間點(diǎn)血管樣結(jié)構(gòu)數(shù)量Fig.6 Capillary density at each time postoperatively by CD31+immunohistochemistry

圖7 術(shù)后第7天大鼠BaSO4溶液活體灌注及游離人工皮瓣體外X線攝片F(xiàn)ig.7 BaSO4solution perfusion of rat 7 days after operation in vivo and X-ray microangiography of isolated artificial skin flap

3 討論

復(fù)雜創(chuàng)面修復(fù)是整復(fù)外科的難題。根據(jù)創(chuàng)面的大小及深度，可選用皮片移植、皮瓣轉(zhuǎn)移及帶蒂游離移植等方法進(jìn)行修復(fù)[4]。Shen[5]提出，在缺乏合適供區(qū)皮瓣以供轉(zhuǎn)移時(shí)，可在皮下埋置血管蒂“預(yù)構(gòu)”皮瓣，修復(fù)創(chuàng)面；在此基礎(chǔ)上，提出的“預(yù)制”皮瓣的方法，擴(kuò)大了皮瓣的制作及應(yīng)用范圍[6]。

單純真皮替代物修復(fù)缺損時(shí)，創(chuàng)基血管建立血供的時(shí)間因缺損部位及大小、缺損程度、受區(qū)創(chuàng)基血運(yùn)及真皮替代物的材質(zhì)等而不同，一般移植后第3天即有血管化跡象，4周后真皮替代物多能被肉芽組織取代，新生血管基本穩(wěn)定[7-10]。然而，真皮替代物作為異體組織存在創(chuàng)基血管延遲或難以長(zhǎng)入的缺陷。因此，可在進(jìn)行真皮替代物覆蓋創(chuàng)面或預(yù)制皮瓣的同時(shí)，移植各種干細(xì)胞[11-12]或細(xì)胞因子[13-21]，以促進(jìn)真皮替代物的血管化進(jìn)程，提高皮瓣的成活率。

本實(shí)驗(yàn)中，我們利用ADM聯(lián)合自體表皮預(yù)制人工皮瓣，關(guān)鍵在于筋膜瓣血管通過(guò)ADM的網(wǎng)孔，并與表皮建立良好血供。腹股溝區(qū)筋膜瓣血供由腹壁淺血管及其分支直接提供，我們將ADM真皮替代物材料直接埋置在筋膜上，同時(shí)回植修薄的大張表皮皮片，局部加壓，以促進(jìn)筋膜瓣血管通過(guò)ADM網(wǎng)孔與表皮組織建立穩(wěn)定血供，保證表皮皮片以及整個(gè)腹股溝區(qū)人工皮瓣的成活。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第3天解除局部敷料的加壓作用后，表皮皮片逐漸壞死。因此，影響人工皮瓣成活的因素除ADM材質(zhì)因素外[22]，還與局部加壓的時(shí)間長(zhǎng)短相關(guān)。

此外，實(shí)驗(yàn)中F344大鼠腹股溝區(qū)皮膚創(chuàng)面設(shè)計(jì)在總面積與長(zhǎng)寬比例上，均大于公認(rèn)的成年大鼠單側(cè)腹壁淺血管所支配的血供范圍，提示我們腹壁淺血管皮瓣在設(shè)計(jì)上可選用更大面積和比例，為后期干細(xì)胞或者細(xì)胞因子促進(jìn)人工皮瓣血管化的研究，提供了易于顯示差異的模型設(shè)計(jì)思路及干預(yù)條件。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，利用ADM和自體表皮構(gòu)建的人工皮瓣在預(yù)制7 d后即可形成營(yíng)養(yǎng)表皮成活的新的血供系統(tǒng)。通過(guò)BaSO4溶液灌注X線攝片可以發(fā)現(xiàn)，由股血管發(fā)出的血管分支術(shù)后第7天在ADM組織中已經(jīng)形成良好的血管網(wǎng)，該血管網(wǎng)的形成是表皮移植成活的重要條件。根據(jù)HE染色與CD31+免疫組化檢測(cè)結(jié)果可以判斷，人工皮瓣的血管生成隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多，直至第21天左右基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，之后血管生成速率減緩，表明預(yù)制的人工皮瓣在第21天能達(dá)到較為可靠的血供狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)將ADM組織與皮瓣預(yù)制的方法相結(jié)合，探索了人工皮瓣的預(yù)制模型及其血管化進(jìn)程，為臨床上疑難創(chuàng)面的修復(fù)開辟了一條新的途徑。

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Vascularization of Artificial Skin Flap Fabricated by Acellular Dermal Matrix

ZHOU Xianyu,LIU Fei,GU Chuan,LUO Xusong,WANG Xi,YANG Qun,YANG Jun.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YANG Jun(E-mail:yj55569@hotmail.com).

ObjectiveTo fabricated the artificial skin flap by using acellular dermal matrix,vascularized fascia and autologous epidermis and to evaluate the time of vascularization in artificial skin flap.Methods Artificial skin flap models were established with Fisher 344 male rats.The artificial skin flaps were harvested for HE staining and CD31+immunohistochemistry on 3,7,14,21,28 days after operation respectively.Microangiography for artificial skin flap was carried out 7 days after operation,the shortest time to complete the process of model establishing.ResultsAll artificial skin flaps presented a good viability without any infection or necrosis in gross observation.Angiogenesis of HE staining and CD31+immunohistochemistry suggested that the total number of vessels increase when prolonging postoperative time and there is a significant difference between every two time intervals(P＜0.05)except between 21 and 28 days after operation(P＞0.05).Microangiography suggests less vessels after removing ADM.ConclusionArtificial skin flap could be successfully fabricated with ADM and autologous epidermis.The capillary vessels of composite skin flap begin to sprout 3 days after operation.Relatively reliable blood supply is basically established between epidermis and fascia on about 7 days after operation.Angiogenesis is completed on about 21 days after operation.

Acellular dermal matrix;Angiogenesis;Autologous epidermis

R622

A

1673－0364（2013）02－0072－04

2013年1月14日；

2013年3月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.003

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（課題編號(hào)：10411964200）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

楊軍（E-mial：yj55569@hotmail.com）。