應(yīng)用犬真皮成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程半月板修復(fù)犬半月板缺損的實驗研究

趙貴慶 王志軍 張 晨 王潔晴 楊檸澤 尹 爍 崔 磊 曹誼林

應(yīng)用犬真皮成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程半月板修復(fù)犬半月板缺損的實驗研究

趙貴慶 王志軍 張 晨 王潔晴 楊檸澤 尹 爍 崔 磊 曹誼林

目的探討體外構(gòu)建組織工程半月板修復(fù)半月板缺損的可行性。方法將體外擴增至第4代的犬真皮成纖維細(xì)胞（Dermal fibroblasts，DFs）接種于PGA/PLA支架材料上，應(yīng)用軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1（Cartilage-derived morphogenetic protein-1，CDMP1）細(xì)胞誘導(dǎo)液體外誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，回植于犬自體半月板缺損模型體內(nèi)，移植后6個月取材觀察半月板的再生情況。結(jié)果誘導(dǎo)組模型內(nèi)形成較大的新生半月板組織，組織學(xué)染色顯示誘導(dǎo)組新生組織更接近于半月板組織的生理特點，尤其是內(nèi)側(cè)部分大部分細(xì)胞表現(xiàn)出軟骨細(xì)胞特有的陷窩結(jié)構(gòu)；非誘導(dǎo)組及空白對照組新生的組織較小，且組織學(xué)表現(xiàn)更類似纖維結(jié)締組織。新生半月板Ⅰ型膠原偏振光檢測顯示，誘導(dǎo)組膠原纖維排列較非誘導(dǎo)組致密，出現(xiàn)Ⅰ型膠原的橫紋特征。掃描電鏡檢測顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞外基質(zhì)與正常半月板相比較疏松，非誘導(dǎo)組細(xì)胞外基質(zhì)則更加疏松。膝關(guān)節(jié)脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨的HE染色顯示，誘導(dǎo)組關(guān)節(jié)面的外側(cè)有新生半月板組織覆蓋的部位關(guān)節(jié)軟骨尚有部分存余，而誘導(dǎo)組已基本消失。結(jié)論組織工程化細(xì)胞材料復(fù)合物能在犬自體半月板缺損模型上實現(xiàn)半月板再生。

真皮成纖維細(xì)胞半月板軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1組織工程

半月板損傷常引起膝關(guān)節(jié)退行性改變，應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)半月板的損傷，具有明顯的優(yōu)勢[1]。本實驗探討真皮成纖維細(xì)胞（Dermal fibroblasts，DFs）體外構(gòu)建組織工程半月板修復(fù)缺損的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CDMP1（PeproTech公司，美國），DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（FBS）（Hyclone公司，美國），鼠抗人CollagenⅡAb3（Neomarkers公司，美國）。

CO2培養(yǎng)箱（Forma公司，美國），無菌超凈工作臺（上海博訊實驗有限公司），恒溫?fù)u床（太倉華美生化儀器廠），普通臺式離心機（TDL-40B，上海安亭醫(yī)療儀器廠），光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），精密電子天平（Sartorius公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 犬DFs的分離、培養(yǎng)，細(xì)胞材料復(fù)合物的制備與體外誘導(dǎo)培養(yǎng)

成年健康Beagle犬18只（購自上海農(nóng)學(xué)院），雌雄不限，體質(zhì)量15~20 Kg。本課題動物實驗經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物委員會批準(zhǔn)。

單絲PGA無紡纖維45 mg，用半月板模具壓制成形，1.5%（w/v）的PLA二氯乙烷溶液塑形PGA支架，制成PGA/PLA支架材料，自然干燥。接種前紫外線消毒30 min，75%乙醇浸泡1 h，PBS沖洗3~5遍，置于DMEM/F12＋10%FBS培養(yǎng)液中，37℃孵育過夜。接種前在相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)液中無細(xì)菌或真菌生長后，用負(fù)壓吸引器將材料中的培養(yǎng)液吸干，即可用于接種細(xì)胞。

將體外擴增至第4代的犬DFs用0.25%胰蛋白酶消化收集，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5×107cells/mL，每個支架材料滴加400 μL的細(xì)胞懸液，均勻接種，放入37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，4.5 h后加入DMEM/F12＋10%FBS培養(yǎng)液。接種次日作為體外培養(yǎng)的第0天，將細(xì)胞材料復(fù)合物移入新的培養(yǎng)皿中，實驗組加入含有100 ng/mL CDMP1的DMEM/ F12＋10%FBS培養(yǎng)液，對照組加入不含CDMP1的DMEM/F12＋10%FBS培養(yǎng)液，同時將未接種細(xì)胞的支架材料作為空白對照組與對照組平行培養(yǎng)。以后隔日更換培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)2周后進行自體回植手術(shù)。

1.2.2 細(xì)胞材料復(fù)合物回植

將體外培養(yǎng)2周的自體細(xì)胞＋PGA/PLA材料復(fù)合物，用脫細(xì)胞的豬小腸黏膜下層（由上海市組織工程研究重點實驗室提供）包裹縫合，植入內(nèi)側(cè)半月板全缺損模型內(nèi)，將復(fù)合物的外側(cè)與內(nèi)側(cè)副韌帶縫合，止血后閉合關(guān)節(jié)囊，縫合膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，逐層縫合皮下組織和皮膚。同時對雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)進行回植手術(shù)，一側(cè)植入CDPM1誘導(dǎo)的細(xì)胞材料復(fù)合物，另一側(cè)植入非誘導(dǎo)的細(xì)胞材料復(fù)合物，另有3只犬一側(cè)植入未接種細(xì)胞的支架材料作為空白對照組，另一側(cè)不作任何處理，作為陽性對照。待實驗動物清醒后，送回籠中，不固定患肢，動物在籠中自由活動。術(shù)后3 d每日肌注青霉素160萬單位。

1.2.3 術(shù)后半月板再生效果的檢測和評價

術(shù)后1周觀察實驗犬的傷口是否有感染跡象，并及時處理，觀察術(shù)后后足站立行走的時間，步態(tài)的恢復(fù)程度，以后每周觀察一次。術(shù)后6個月時，心內(nèi)注射KCl溶液處死實驗犬，解剖膝關(guān)節(jié)。大體觀察新生的半月板組織大小、形態(tài)、質(zhì)地、相鄰關(guān)節(jié)面的完整性，并拍照。切取新生半月板組織，4%中性多聚甲醛固定2 h，脫水，石蠟包埋、切片，進行HE染色和鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色及偏振光觀察。并切取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)負(fù)重部位的脛骨平臺，甲酸甲醛脫鈣液中脫鈣2周，石蠟包埋、切片，進行HE染色。切取新生半月板組織中間部分約0.5 cm大小（最寬處），用低溫冷凍干燥法干燥48 h，樣品以導(dǎo)電膠固定，噴金，掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 DFs在支架材料上的黏附和增殖

其中：GField為現(xiàn)場值的預(yù)測值；FA為現(xiàn)場的時間因數(shù)；GPrimary是主固結(jié)完成時測得的最大動剪切模量。

DFs接種支架材料后1周，倒置相差顯微鏡和Confocal激光共聚焦顯微觀察顯示，細(xì)胞在支架材料上黏附良好，隨著培養(yǎng)時間的延長，支架材料表面的細(xì)胞密度逐漸增大（圖1）。

2.2 術(shù)后觀察

所有實驗動物術(shù)后第3天，可后腿站力，緩慢跛行；術(shù)后6天跛行改善，術(shù)后2周跛行不明顯。直至實驗結(jié)束，實驗動物無明顯的后肢運動障礙，實驗結(jié)束時均能雙后腿站立。各組無明顯差別。

2.3 回植術(shù)后6個月大體觀察

CDMP1誘導(dǎo)組新生的半月板組織形狀更加規(guī)則，前角與后角均與脛骨平臺前橫韌帶和后橫韌帶愈著，外側(cè)與關(guān)節(jié)囊緊密附著，新生半月板組織表面光滑，具有軟骨光澤，內(nèi)側(cè)緣部位呈半透明狀，與正常半月板的內(nèi)側(cè)緣非常接近。非誘導(dǎo)對照組和單純支架材料組新生的組織量較小，尤其是前角和內(nèi)側(cè)部位細(xì)小，表面不如實驗組的光滑，也沒有明顯的軟骨光澤，內(nèi)側(cè)緣不光滑，邊緣厚而鈍，沒有正常半月板的半透明外觀（圖2）。

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色觀察顯示，實驗組新生半月板的內(nèi)側(cè)緣尖端細(xì)胞表現(xiàn)為典型的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)特征，僅個別細(xì)胞沒有軟骨陷窩外觀，細(xì)胞外基質(zhì)紅染，未見正常半月板相應(yīng)部位那樣粗大的膠原纖維束形成，細(xì)胞外基質(zhì)呈無定形外觀，有少量紊亂的細(xì)小纖維束分布；實驗組水平切面內(nèi)側(cè)緣部位細(xì)胞單個或成對出現(xiàn)，呈典型的軟骨細(xì)胞特征，細(xì)胞外基質(zhì)紅染，表現(xiàn)為紊亂的膠原纖維排列，與正常半月板組織相比細(xì)胞密度略大，也就是說，細(xì)胞外基質(zhì)不如正常半月板組織豐富；實驗組新生半月板組織內(nèi)部可見有粗大的膠原纖維束的形成，細(xì)胞仍表現(xiàn)為典型的軟骨細(xì)胞，沿纖維束平行排列，與正常半月板組織相比，纖維束不夠致密。非誘導(dǎo)組新生半月板組織內(nèi)側(cè)緣光滑，但是與實驗組和正常半月板相比較厚鈍，除少數(shù)細(xì)胞具有軟骨陷窩形態(tài)特征外，大部分細(xì)胞無陷窩結(jié)構(gòu)，細(xì)胞邊界不清；新生半月板表面細(xì)胞密度較大，組織內(nèi)大量紅染的細(xì)胞外基質(zhì)形成紊亂分布的膠原纖維束，其間可見大量的血管系統(tǒng)。單純支架材料組新生半月板組織內(nèi)側(cè)緣有大量細(xì)胞呈軟骨陷窩結(jié)構(gòu)特征，組織內(nèi)部細(xì)胞外基質(zhì)有大量成束分布的纖維束，不規(guī)則地呈平行波浪狀走行，細(xì)胞位于纖維束之間，各部分均有大量細(xì)胞呈軟骨陷窩特征（圖3）。

誘導(dǎo)組新生半月板組織內(nèi)部纖維束之間有零星的Ⅱ型膠原陽性物質(zhì)，但是其密度不如正常半月板組織大；與正常半月板組織外側(cè)相同，在新生半月板的外側(cè)1/3未見有陽性表達（圖4）

2.5 偏振光檢測

誘導(dǎo)組膠原纖維平行排列致密，纖維比較粗大，出現(xiàn)Ⅰ型膠原的橫紋特征；非誘導(dǎo)組膠原纖維密度沒有誘導(dǎo)組高，且纖維排列紊亂（圖5）。

2.6 掃描電鏡檢測

誘導(dǎo)組回植術(shù)后6個月，冠狀切面見細(xì)胞外基質(zhì)呈網(wǎng)格狀，基質(zhì)密度較大，與正常半月板相比網(wǎng)格直徑較大，相對疏松；非誘導(dǎo)組冠狀切面中，細(xì)胞外基質(zhì)更加疏松，呈絲網(wǎng)狀，網(wǎng)格之間互相貫通（圖6）。

2.7 新生半月板組織對脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨的保護作用

術(shù)后6個月取材的膝關(guān)節(jié)脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨HE染色顯示，實驗組在關(guān)節(jié)面的外側(cè)有新生半月板組織覆蓋的部位，關(guān)節(jié)軟骨尚有部分存余，而在脛骨平臺的內(nèi)側(cè)，關(guān)節(jié)軟骨已不存在，而且關(guān)節(jié)下骨也有一定程度的磨損；非誘導(dǎo)組脛骨平臺的外側(cè)也未發(fā)現(xiàn)有關(guān)節(jié)軟骨的存余，而脛骨平臺的內(nèi)側(cè)，軟骨下骨已被磨損殆盡，骨小梁有暴露和斷裂現(xiàn)象（圖7）。

圖1 DFs在支架材料上的黏附和增殖Fig.1Adhesion and proliferation of DFs on scaffold material

圖2 體內(nèi)6個月后新生半月板組織大體觀Fig.2 Gross view of newly formed tissue 6 months after implantation

圖3 回植后6個月各組半月板組織學(xué)觀察（內(nèi)側(cè)緣、水平切面及新生組織內(nèi)部）Fig.3 Histological observation of regenerated meniscus 6 months after implantation(the inner edge,the superficial layer and inner part)

圖4 新生半月板組織中Ⅱ型膠原的分布Fig.4 Distribution of collagen type II in the regenerated meniscus 6 months after implantation

圖5 新生半月板Ⅰ型膠原偏振光檢測，F(xiàn)ig.5 Polarizing microscope examination of the regenerated meniscus

圖6 回植術(shù)后6個月新生半月板組織掃描電鏡觀察Fig.6 SEM evaluation of the new regenerated meniscus 6 months after implantation

圖7 新生半月板組織對脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨的保護（箭頭所指部分為新生半月板組織覆蓋的部分）Fig.7 The protective function of newly formed meniscus on tibial plateau(The arrows indicate the covered cartilage)

3 討論

半月板損傷的治療，應(yīng)在盡可能保留半月板組織的原則下，改善膝關(guān)節(jié)的功能和癥狀。對于因嚴(yán)重半月板撕裂傷而行半月板切除術(shù)的患者，目前尚無很好的修復(fù)方法。纖維軟骨組織工程的發(fā)展提供了新的思路。應(yīng)用同種異體半月板細(xì)胞作為種子細(xì)胞，PGA/PLA作為支架材料，實現(xiàn)了兔內(nèi)側(cè)半月板全缺損的再生，證明半月板的完整再生是可能的[2]。本研究將體外擴增至第4代的DFs接種在PGA/PLA支架上，應(yīng)用含有100 ng/mL CDMP1的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)2周后，植入自體內(nèi)側(cè)半月板全缺損處，術(shù)后6個月時，組織學(xué)檢測表明新生組織與正常半月板組織非常相似，具有纖維軟骨的組織學(xué)特征。

我們的早期研究表明，DFs在PGA支架材料上培養(yǎng)4周后可出現(xiàn)軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)，向軟骨細(xì)胞表型分化[3-4]。本實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組體外培養(yǎng)2周后，相比非誘導(dǎo)組形成的纖維軟骨組織更加成熟，組織量也更大，說明DFs在三維條件下培養(yǎng)2周已經(jīng)從基因表達上轉(zhuǎn)化為軟骨細(xì)胞。在二維條件下誘導(dǎo)1周的DFs已經(jīng)向軟骨細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，但是并不能維持[5]，牛韌帶成纖維細(xì)胞以相同方法誘導(dǎo)1周后也發(fā)現(xiàn)有向軟骨細(xì)胞表型的分化[6]。所以我們推測，體外誘導(dǎo)2周的細(xì)胞材料復(fù)合物，DFs的表型已經(jīng)發(fā)生了改變。

膝關(guān)節(jié)內(nèi)具有良好的軟骨再生環(huán)境?；刂?個月的標(biāo)本中可以看到，誘導(dǎo)組中有大量具有軟骨陷窩結(jié)構(gòu)的細(xì)胞出現(xiàn)，而非誘導(dǎo)組和空白支架材料組中僅有少量具有軟骨陷窩特征的細(xì)胞。因為回植入關(guān)節(jié)內(nèi)的DFs在關(guān)節(jié)內(nèi)條件下，部分DFs有可能向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[7-9]。另外，關(guān)節(jié)內(nèi)脫落的細(xì)胞是一個重要的來源，術(shù)后6個月時內(nèi)側(cè)脛骨平臺的切片染色顯示大部分關(guān)節(jié)軟骨被嚴(yán)重磨損，非誘導(dǎo)組和空白對照組幾乎沒有關(guān)節(jié)軟骨殘余，那么這些脫落的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞除了大部分隨關(guān)節(jié)液循環(huán)被關(guān)節(jié)囊中的巨噬細(xì)胞吸收外，可能有部分進入回植的細(xì)胞材料復(fù)合物中。有研究表明，將羊的肋軟骨膜植入內(nèi)側(cè)半月板缺損處，在術(shù)后3、6、9個月時，均形成了纖維軟骨樣組織[10]。第三，骨髓來源的間充質(zhì)細(xì)胞有可能進入細(xì)胞材料復(fù)合物中，分化為纖維軟骨細(xì)胞?；刂彩中g(shù)中會使關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成大量的血腫，可能含有從骨髓來源的干細(xì)胞，在關(guān)節(jié)內(nèi)成軟骨環(huán)境下會向纖維軟骨表型分化，在回植后6個月時形成纖維軟骨表型的細(xì)胞。已經(jīng)有大量的研究表明，骨髓干細(xì)胞可以向軟骨細(xì)胞定向分化[11-13]，狗的自體骨髓干細(xì)胞懸液注射在半月板撕裂部分，發(fā)現(xiàn)半月板愈合能力明顯較對照組強[14]。本實驗中，術(shù)后6個月時脛骨平臺切片染色顯示，各組中均有關(guān)節(jié)軟骨的明顯磨損，在非誘導(dǎo)組和空白對照組中，負(fù)重部分的軟骨下骨都被磨損殆盡，甚至可見有斷裂的骨小梁，這樣必然有骨髓液進入關(guān)節(jié)內(nèi)，這也有可能是骨髓干細(xì)胞進入新生半月板組織的一個途徑。要闡明這個問題，還需要進一步的實驗，將植入的DFs以特異的標(biāo)志物加以標(biāo)記，然后在取材的標(biāo)本上區(qū)分新生組織中纖維軟骨細(xì)胞的來源。

半月板在膝關(guān)節(jié)內(nèi)的功能多樣性決定了其結(jié)構(gòu)特點。半月板絕大部分細(xì)胞外基質(zhì)為Ⅰ型膠原，此外在內(nèi)側(cè)1/3還有少量的Ⅱ型膠原和黏多糖成分，該區(qū)域無血管分布，又稱為“白區(qū)”，主要傳導(dǎo)來自股骨的壓力負(fù)荷。半月板外側(cè)1/3具有血管系統(tǒng)，又稱為“紅區(qū)”，組織結(jié)構(gòu)與肌腱非常相似[15]，粗大的膠原纖維呈弧形分布，主要承受來自股骨髁的側(cè)向剪切力，也就是承受拉力負(fù)荷。在回植術(shù)后6個月時，實驗組新生的半月板組織表現(xiàn)為內(nèi)側(cè)部分無血管分布，細(xì)胞呈典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)，而外側(cè)部分有血管分布，且細(xì)胞的軟骨形態(tài)不典型，細(xì)胞外基質(zhì)中可見有粗大的膠原纖維分布。而在非誘導(dǎo)組和空白對照組，在新生組織的內(nèi)側(cè)緣都可以看到有毛細(xì)胞血管的分布，且細(xì)胞也沒有軟骨細(xì)胞的特征。這充分證明關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境對新生半月板組織不同部位的力學(xué)刺激決定了DFs的分化命運。

細(xì)胞材料復(fù)合物的機械性能對于全半月板的再生具有重要的意義。本實驗中應(yīng)用的PGA/PLA支架材料已經(jīng)被用于兔全半月板再生和豬關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重部位的再生研究[16]，都取得了令人滿意的結(jié)果。本實驗中，并不是將細(xì)胞材料復(fù)合物直接回植，而是在體外培養(yǎng)2周后回植，此時的復(fù)合物強度明顯低于剛接種時。在回植術(shù)后6個月時取材標(biāo)本的大體觀可見，雖然CDMP1誘導(dǎo)組形成的新生半月板組織量大于非誘導(dǎo)組和空白對照組，但是與正常內(nèi)側(cè)半月板相比都要小很多，而且脛骨平臺切片染色也表明負(fù)重部位的關(guān)節(jié)軟骨不論在哪個組都全部磨損。這說明各組植入物均不能滿足半月板在膝關(guān)節(jié)內(nèi)所需要承受的生物力學(xué)要求。半月板特殊的幾何形狀是關(guān)節(jié)內(nèi)各種力學(xué)刺激的結(jié)果，它有效地傳導(dǎo)了來自股骨髁的應(yīng)力并將其分散在脛骨平臺上，當(dāng)這種應(yīng)力傳導(dǎo)和分散作用消失后，來自股骨的強大應(yīng)力集中在了股骨內(nèi)側(cè)髁最突點與脛骨平臺接觸部位，局部應(yīng)力的增大迅速引起關(guān)節(jié)的退行性改變，中心部位透明軟骨變薄消失的時候，鄰近的軟骨也就相繼發(fā)生這種退行性改變。所以，還需要研究一種新型的支架材料以適應(yīng)膝關(guān)節(jié)內(nèi)的力學(xué)環(huán)境。

本實驗提示，應(yīng)用含有100 ng/mL的CDMP1培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞材料復(fù)合物2周，真皮成纖維細(xì)胞可以向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。CDMP1誘導(dǎo)后的細(xì)胞材料復(fù)合物能在犬自體內(nèi)側(cè)半月板全缺損模型上實現(xiàn)半月板的再生，新生半月板組織具有正常半月板特有的組織學(xué)特征。

[1]Fox DB,Cook JL,Kuroki K,et al.Effects of dynamic compressive load on collagen-based scaffolds seeded with fibroblast-like synoviocytes[J].Tissue Eng,2006,12(6)：1527-1537.

[2]Yates KE.Inferred functions of novel genes identified in fibroblasts chondroinduced by demineralized bone[J].DNA Cell Biol,2004,23(1)：15-24.

[3]Zhao GQ,Yin S,Liu GP,et al.In vitro engineering of fibrocartilage using CDMP1 induced dermal fibroblasts and polyglycolide[J].Biomaterials,2009,30(19)：3241-3250.

[4]崔磊,尹爍,鄧辰亮.軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞表達軟骨細(xì)胞表型的實驗研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(15)：1304-1309.

[5]趙貴慶,崔磊,曹誼林.軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)犬真皮成纖維細(xì)胞向軟骨細(xì)胞表型分化的實驗研究[J].組織工程與重建外科,2011,7(3)：139-142.

[6]Yoo JU,Barthel TS,Nishimura K,et al.The chondrogenic potential of humanbone-marrow-derive dmesen chymalprogenitor cells[J].J Bone Joint Surg Am,1998,80(12)：1745-1757.

[7]Kohn D,Rudert M,Wirth CJ,et al.Medial meniscus replacement by a fat pad autograft.An experimental study in sheep[J].Int Orthop,1997,21(4)：232-238.

[8]Gwendolyn M,Hoben BS,Kyriacos A.Meniscal repair with fibrocartilage engineering[J].Sports Med Arthrosc Rev,2006,14 (3)：129-137.

[9]Hoben GM,Koay EJ,Athanasiou KA.Fibrochondrogenesis in two embryonic stem cell lines：effects of differentiation timelines[J]. Stem Cells,2008,26(2)：422-430.

[10]Gastel JA,Muirhead WR,Lifrak JT,et al.Meniscal tissue regeneration using a collagenous biomaterial derived from porcine small intestine submucosa[J].Arthroscopy,2001,17(2)：151-159.

[11]Ibarra C,Jannetta C,Cao Y,et al.Tissue engineered meniscus：a potential new alternative to allogeneic meniscus transplantation [J].Transplant Proc,1997,29(1-2)：986-988.

[12]Martinek V,Ueblacker P,Braun K,et al.Second generation of meniscus transplantation in vivo study with tissue engineered meniscus replacement[J].Arch Orthop Trauma Surg,2006,126(4)：228-234.

[13]Steadman JR,Rodkey WG.Tissue-engineered collagen meniscus implants：5-to 6-year feasibility study results[J].Arthroscopy, 2005,21(5)：515-525.

[14]Aufderheida AC,Athanasiou KA.Comparison of scaffolds and culture conditions for tissue engineering of the knee meniscus[J]. Tissue Eng,2005,11(7-8)：1095-1104.

[15]崔一民.半月板的生物學(xué)特性及其組織工程修復(fù)的進展[J].中國創(chuàng)傷骨科雜志,2000,2(1)：60-62.

[16]Pangborn CA,Athanasiou KA.Growth factors and fibrochondrocytes in scaffolds[J].J Ortho Res,2005,23(5)：1184-1190.

Tissue Engineered Meniscus Constructed by DFs in the Repair of Meniscus Defects1,WANG Zhijun1,

ZHAO Guiqing ZHANG Chen1,WANG Jieqing1,YANG Ningze1,YIN Shuo2,CUI Lei2,CAO Yilin2.1 Xinhua Hospital,Dalian University, Liaoning 116021;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHAO Guiqing(E-mail:649888966@qq.com),CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of using tissue engineered meniscus to repair meniscus defects.Methods DFs isolated from canine and expanded to the fourth passage were seeded in PGA/PLA scaffold and induced with CDMP1 for 2 weeks,then implanted to repair defects of autologous medial meniscus.Six months after implantation,the new formed meniscus were harvested for detection.ResultsThe constructs of CDMP1 induced group formed cartilage-like tissue,and most cells demonstrated a typical morphological characteristic of chondrocyte especially in the inner edge.Whereas the noninduced group generated smaller and more fibrous like tissue,and only a few cells present lacuna like structure.Polarizing microscope examination showed that the bundles of collagen typeⅠin CDMP1 induced group was thicker than that in noninduced group.SEM evaluation demonstrated more dense ECM in CDMP1 induced group compared with non-induced group, but significantly less than normal meniscus.HE staining of newly formed meniscus on tibial plateau showed more degree of protection for covered hyaline cartilage in CDMP1 induced group compared with non-induced group.ConclusionTissue engineered constructs can further improve meniscus regeneration to repair the autologous meniscus defects.

Dermal fibroblasts;Meniscus;Cartilage-derived morphogenetic protein-1;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）02－0066－07

2013年1月14日；

2013年3月3日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.002

116021遼寧省大連市大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院（趙貴慶，王志軍，張晨，王潔晴，楊檸澤）；200011上海市上海市組織工程研究重點實驗室（尹爍，崔磊，曹誼林）。

趙貴慶（E-mail：649888966@qq.com）。