腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 在NSCLC中的表達(dá)及臨床意義

梁洪享 鐘 竑 羅 勇 黃 燕 丁昭珩 丁 罡

腫瘤干細(xì)胞是目前腫瘤研究熱點(diǎn)之一，目前非小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物研究最多的有CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 等，但關(guān)于它們在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)的相互關(guān)系的報(bào)道比較少見，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測非小細(xì)胞肺癌的石蠟標(biāo)本，探索它們在非小細(xì)胞肺癌組織中的相互表達(dá)關(guān)系及其生物學(xué)意義，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年1月至2011年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院崇明分院手術(shù)切除的70例非小細(xì)胞肺癌病例的組織標(biāo)本，所有病例病史資料完整，術(shù)前未行放化療。另外選取14例非癌組織(包括癌旁及炎性肺組織)石蠟標(biāo)本作為對照組。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑

SOX2小鼠抗人抗體、OCT4小鼠抗人抗體，來源于cell signaling technology公司;CD133兔抗人抗體、CD44兔抗人抗體和ALDH1兔抗人抗體來源于武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

免疫組化二步法染色嚴(yán)格按照試劑說明書操作步驟進(jìn)行，抗原修復(fù)采用高壓熱修復(fù)。陰性對照組:PBS磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對照。陽性對照組:CD133以肝癌為陽性對照;CD44以扁桃腺為陽性對照;SOX2以乳腺癌為陽性對照;OCT4以精原細(xì)胞瘤為陽性對照;ALDH1以肝癌為陽性對照。

1.4 陽性結(jié)果判斷

考慮到腫瘤干細(xì)胞只占了腫瘤細(xì)胞中極少的一部分，大約占1% ～4%左右［1］，因此免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn)參照 Terpe 等［2］、許良中等［3］、王翌慶［4］、Horst等［5］方法并作調(diào)整，即計(jì)算陽性細(xì)胞百分比并結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞數(shù)為0則為陰性(0分)，＞0則為陽性，陽性再分為強(qiáng)陽性(2分:強(qiáng)染色強(qiáng)度細(xì)胞在陽性細(xì)胞中占70%以上)、弱陽性(1分:達(dá)不到強(qiáng)陽性條件的歸為弱陽性)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SAS 8.02軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 表達(dá)間相互關(guān)系及上述指標(biāo)雙陽性組合與NSCLC病理分化的關(guān)系比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況

CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 蛋白陽性表達(dá)為境界清晰、突出于背景的棕黃色，CD133陽性顆粒主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，CD44蛋白主要定位于細(xì)胞膜，ALHD1定位于細(xì)胞質(zhì)，SOX2定位于細(xì)胞核，OCT4定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在70例NSCLC組織中陽性表達(dá)率分別為88.57%、98.57%、100.00%、100.00%、100.00%，強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為 48.57%、67.14%、67.14%、31.43%、50.00%。

2.2 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 間共表達(dá)的關(guān)系

在 NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1間共表達(dá)的關(guān)系見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，只有CD44與SOX2共表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，提示NSCLC組織中CD44與SOX2的表達(dá)可能存在共同表達(dá)的關(guān)系。

表1 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 間共表達(dá)的關(guān)系(例)

2.3 雙強(qiáng)陽性指標(biāo)的組合CD44++SOX2++、CD44++ALDH1++、SOX2++ALDH1++、CD133++SOX2++與NSCLC病理分化程度的關(guān)系(表2)

NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1某兩個(gè)指標(biāo)均為強(qiáng)陽性的比例較高，70例NSCLC中 CD44++SOX2++ 組合占38.57%(27/70)，CD44++ALDH1++ 組合占 34.29%(24/70)，SOX2++ALDH1++組合占34.29%(24/70)，CD133++SOX2++組合占31.43%(22/70)。上述表現(xiàn)雙強(qiáng)陽性組織與其他非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織比較，病理分化程度方面均有差別，雙強(qiáng)陽性NSCLC組織多為中、低分化，而非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織傾向高分化。雙強(qiáng)陽性組織與其他非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織在病理分化程度方面比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P值分別為 0.0022、0.0463、0.0463、0.003)。

表2 各組合與NSCLC病理分化程度的關(guān)系(例)

3 討論

肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中，非小細(xì)胞肺癌占肺癌的80%以上，1/3的患者診斷時(shí)已經(jīng)為中晚期，嚴(yán)重威脅人們的身心健康［6］。目前尚無有效的方法早期發(fā)現(xiàn)及治愈這種疾病，中晚期肺癌經(jīng)過系統(tǒng)的放化療甚至是靶向治療聯(lián)合化療的無病進(jìn)展期6.2 個(gè)月、總生存期 12.3 個(gè)月左右［7］，總體的治療效果仍然較差。目前腫瘤方面的研究熱點(diǎn)之—腫瘤干細(xì)胞學(xué)說有望在腫瘤的預(yù)防、診斷及治療上取得突破。腫瘤干細(xì)胞(tumor stem cell，TSC)是腫瘤內(nèi)存在一小部份具有胚胎干細(xì)胞類似性質(zhì)的細(xì)胞，它具有無限增值、自我更新的能力，并保持著多潛能分化及高致癌性的特點(diǎn)［8］，它處于靜止期，從而使常規(guī)治療失敗及轉(zhuǎn)移、耐藥的出現(xiàn)［2］。目前，有關(guān)肺癌干細(xì)胞的研究已經(jīng)成為肺癌研究的熱點(diǎn)之一。

最早確定的急性白血病的腫瘤干細(xì)胞的表型是CD34+CD38-Thy-［9］，另外一個(gè)比較明確的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志為乳腺癌腫瘤干細(xì)胞表型;CD44+CD24-/low［10-11］。目前，肺癌干細(xì)胞及其特異性標(biāo)記物尚不明確［12］，研究最多的是參照其他腫瘤干細(xì)胞和人體多能干細(xì)胞的標(biāo)記物，如:CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1 等［13］。本研究以 CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1為研究對象，研究它們在NSCLC組織中的表達(dá)的相互關(guān)系。結(jié)果顯示 CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1在NSCLC組織中陽性表達(dá)率及強(qiáng)陽性表達(dá)率均很高。人CD133基因位于4號染色體，CD133蛋白為細(xì)胞膜蛋白超家族成員，它主要在細(xì)胞及器官成熟過程中起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，它是腦膠質(zhì)瘤腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，并與腦膠質(zhì)瘤化療耐藥有關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)CD133在NSCLC組織中的表達(dá)陽性率達(dá)88.57%，其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為48.57%;CD44是1種黏附分子，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，本研究CD44表達(dá)的陽性率為98.57%，其中強(qiáng)陽性表達(dá)率為67.14%，與有些研究發(fā)現(xiàn)CD44在肺鱗癌中的表達(dá)率為89.5%相仿［15］。SOX2、OCT4、ALDH1 均是多能干細(xì)胞的標(biāo)記物，也是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記，本研究發(fā)現(xiàn) SOX2、OCT4、ALDH1在NSCLC中表達(dá)的陽性率均為100%，其中強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為 67.14%、31.43%、50.00%。SOX2是一個(gè)維持干細(xì)胞多潛能性的基因，Sholl等［16］研究提示94%的肺鱗癌干細(xì)胞表達(dá)SOX2;OCT4也稱OCT3，是屬于POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，有研究發(fā)現(xiàn) OCT4分為 OCT4-A和 OCT4-B，其中，OCT4-A+參與肺腺癌的形成［17］;ALDH1(乙醛脫氫酶1)是在干細(xì)胞分化早期催化視黃醇氧化為視黃酸的1種酶，是造血組織或其他一些組織中正常干細(xì)胞生長、分化的必需物質(zhì)。

在 NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1之間共表達(dá)的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，CD44與SOX2存在共表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028)，這提示在NSCLC組織中CD44與SOX2的表達(dá)可能存在共同表達(dá)的關(guān)系。但令人費(fèi)解的是，既然CD44與SOX2在NSCLC組織中存在共同表達(dá)的關(guān)系，那么它們在NSCLC組織中某些生物學(xué)行為應(yīng)該是一致的，但在與NSCLC臨床因素分析中發(fā)現(xiàn)，CD44在高齡患者中表達(dá)明顯，而SOX2在低年齡患者中表達(dá)明顯。故考慮CD44與SOX2在NSCLC組織中共表達(dá)關(guān)系可能是由于兩者強(qiáng)陽性表達(dá)率高影響所致，其現(xiàn)實(shí)意義有待進(jìn)一步研究。

在腫瘤干細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的表型往往由幾個(gè)特征性的標(biāo)記物組合而成，如急性白血病腫瘤干細(xì)胞的表型是CD34+CD38-Thy-［9］，乳腺癌腫瘤干細(xì)胞表型是 CD44+CD24-/low［10-11］等。NSCLC腫瘤干細(xì)胞的表型是否也是由兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物分子特征性組合而成的呢?參照上述腫瘤干細(xì)胞由兩個(gè)或多個(gè)分子標(biāo)記組成的方法，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC組織中CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 的表達(dá)某兩個(gè)指標(biāo)均為強(qiáng)陽性的比例較高，如:70例NSCLC中CD44++SOX2++組合占38.57%，CD44++ALDH1++組合占34.29%，SOX2++ALDH1++ 組合占 34.29%，上述分子表型為雙強(qiáng)陽性的組織與其他非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織比較，在病理分化程度上均有差別，雙強(qiáng)陽性的組織更多為中、低分化的NSCLC組織，而非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織傾向高分化，而且它們與其他非雙強(qiáng)陽性NSCLC組織在分化程度上比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異(P 值分別為 0.0022、0.0463、0.0463、0.003)?？傊?，CD44++SOX2++、CD44++ALDH1++、SOX2++ALDH1++、CD133++SOX2++這4個(gè)組合有可能為研究NSCLC腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物提供參考，需要通過檢測及分離表達(dá)此類標(biāo)記的陽性的細(xì)胞，進(jìn)一步行致瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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