48份分蘗洋蔥種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR標(biāo)記和農(nóng)藝性狀分析

金 雪 周新剛 劉守偉 劉淑芹 吳鳳芝

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

分蘗洋蔥（Allium cepavar.aggregatum）為百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium）一年生栽培草本植物，是洋蔥的一個(gè)變種（李曙軒 等，1979；崔崇士和傅喜山，2000）。分蘗洋蔥營(yíng)養(yǎng)豐富，藥用價(jià)值較高，是重要的世界性蔬菜和調(diào)味品，在我國(guó)東北地區(qū)，如黑龍江、吉林等地廣泛種植。分蘗洋蔥生育期短，病蟲害較輕，能有效提高土地復(fù)種指數(shù)，減少農(nóng)藥使用量，適于發(fā)展綠色食品，市場(chǎng)前景較好。但長(zhǎng)期以來分蘗洋蔥品種的篩選鑒定工作尚不深入，品系分類不清楚，可能存在同物異名現(xiàn)象，不利于分蘗洋蔥的推廣和應(yīng)用。

目前同工酶標(biāo)記（Rouamba et al.，2001；高述民 等，2003；張光花 等，2003）、SSR（Simple sequence repeats）標(biāo)記技術(shù)（Fischer ＆ Bachmann，2000；李慧芝 等，2007；周靜 等，2011）、ISSR（Inter-simple sequence repeat）標(biāo)記技術(shù)（徐啟江 等，2007；劉宏敏 等，2011）、rDNA原位雜交技術(shù)（Ricroch et al.，1992）及形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法（Sangecta et al.，2006）已廣泛用于大蔥、大蒜、洋蔥等蔥屬作物的遺傳多樣性研究，并已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。而分蘗洋蔥種質(zhì)資源的遺傳多樣行分析尚處于起步階段（初文嬌，2010）。

由Zietkiewicz 等（1994）發(fā)展起來的ISSR（Inter-simple sequence repeat）技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、多態(tài)性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，已在許多作物的親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性研究等方面得到了廣泛應(yīng)用（王武臺(tái) 等，2011）。本試驗(yàn)搜集了在黑龍江省和吉林省廣泛種植的48份分蘗洋蔥種質(zhì)資源，對(duì)其進(jìn)行了田間農(nóng)藝性狀調(diào)查和ISSR 標(biāo)記，以期揭示其遺傳多樣性及親緣關(guān)系，為分蘗洋蔥的品種評(píng)價(jià)與鑒定、引種栽培等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的分蘗洋蔥材料共48份（表1），為從黑龍江省和吉林省不同地區(qū)搜集的地方品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間農(nóng)藝性狀調(diào)查 田間試驗(yàn)于2011年4～7月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行。48份分蘗洋蔥材料每份材料播種1行，行距30 cm，行長(zhǎng)9 m，有效播種數(shù)為180株，株距5 cm。田間管理按常規(guī)進(jìn)行。調(diào)查的農(nóng)藝性狀包括分蘗洋蔥的幼葉色、是否抽薹、鱗莖色和單球質(zhì)量。于種植后30 d（幼苗期）觀察分蘗洋蔥的幼葉色，將幼葉色劃分為3 類：淺綠、翠綠和深綠；種植后90 d（收獲前）調(diào)察是否抽薹；收獲后觀察鱗莖色，將鱗莖色劃分為4 類：淺棕黃色、棕黃色、黃色和紫黃色。

1.2.2 基因組DNA 提取 植株長(zhǎng)至3～4片葉時(shí)，取分蘗洋蔥嫩葉的新鮮組織并保存于-80℃冰箱。采用TIANGEN 公司柱式植物基因組試劑盒進(jìn)行基因組DNA 提取。提取的基因組DNA 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。

1.2.3 ISSR分析 ISSR所用引物序列見表2（姜福星，2006；徐啟江 等，2007；鄧文明，2008），由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 反應(yīng)總體積為50 μL，其中10×Buffer 5 μL，Mg2+3 μL，dNTP 4 μL，DNA 20 ng，Taq酶（TIANGEN 公司）0.8 U，10 μmol·L-1引物2 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad PTC200 PCR 儀（Bio-Rad 公司）上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；35個(gè)熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s；終延伸72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，100 V 電壓，150～180 min，并以100～2 000 bp 標(biāo)準(zhǔn)分子量為對(duì)照。用Gelred 染色20 min后，用紫外分析儀觀察并記錄擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 ISSR 電泳結(jié)果，對(duì)清晰可辨的電泳條帶全部用于統(tǒng)計(jì)分析，按擴(kuò)增條帶有無記數(shù)，當(dāng)某一擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)，賦值為“1”，不存在時(shí)賦值為“0”，從而把圖形資料轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)資料。根據(jù)Nei 和Li（1979）相似系數(shù)法求得品種i和j之間的相似系數(shù)（GSij）：GSij=2Nij/（Ni+Nj），其中，Nij表示品種i，j共有的條帶數(shù)目，Ni表示品種i中的條帶數(shù)目；Nj表示品種j中的條帶數(shù)目。利用NTSYSpc Version2.0 軟件（Rohlf，1987）按照UPGMA法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建樹狀圖。

表型性狀數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用NTSYS 軟件分析，按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA 聚類分析。

表2 所用引物序列及其多態(tài)性

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR 多態(tài)性分析

從51條ISSR 引物中篩選出了13條能擴(kuò)增出清晰帶型、多態(tài)性較好的引物。這13條引物中有7條二核苷酸重復(fù)序列，1條三核苷酸重復(fù)序列，1條四核苷酸重復(fù)序列，4條簡(jiǎn)并性核苷酸重復(fù)序列。二核苷酸重復(fù)序列中（CT）n 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，說明分蘗洋蔥基因組中含有豐富的CT 重復(fù)序列，這為下一步利用ISSR 標(biāo)記定向開發(fā)分蘗洋蔥SSR 引物奠定了基礎(chǔ)。

用13條引物（表2）對(duì)48份分蘗洋蔥材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，所擴(kuò)增的片段大小在100～2 000 bp 之間（圖1）。13條引物共擴(kuò)增出132條條帶，其中多態(tài)性條帶109條，多態(tài)百分率（P）為82.6%，平均每條引物擴(kuò)增出10.15條條帶（表2）。其中，引物3A35 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多，為18條，多態(tài)百分率為94.4%；引物UBC812 擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，為3條；多態(tài)性最高的引物是UBC840，多態(tài)百分率達(dá)100%（表2）。說明ISSR 標(biāo)記擴(kuò)增效率較高且多態(tài)性較好。

圖1 引物UBC840 對(duì)48份分蘗洋蔥材料的ISSR 擴(kuò)增電泳圖譜

2.2 ISSR 標(biāo)記聚類分析

48份分蘗洋蔥的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.59～0.94，平均為0.75，表現(xiàn)出豐富的多樣性。其中賓縣1 和賓縣2，白城1 和雙城2 之間的相似系數(shù)最大，均為0.94，表明其親緣關(guān)系較近；綏化和阿城、四平和南方毛蔥、五常紅七社和四六瓣的相似系數(shù)最小，均為0.59，表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。吉林省和黑龍江省兩省樣品的相似系數(shù)變化范圍分別為0.62～0.90、0.59～0.94，平均相似系數(shù)為吉林省0.72<黑龍江省0.74，表明來自黑龍江省的樣品遺傳多樣性低于來自吉林省樣品。

從聚類分析樹狀圖（圖2）可以看出，在相似系數(shù)為0.75（L1）處，48份分蘗洋蔥資源可分為3 類：Ⅰ類有6份資源來自吉林省，17份來自黑龍江省，相似系數(shù)為0.73～0.94，該類中可繼續(xù)分為若干亞類和次亞類，遺傳多樣性較豐富；Ⅱ類只包括1份資源，為來源于黑龍江省的南方毛蔥，在相似系數(shù)為0.71 的水平上與其他所有材料分開，表明這份材料有特殊的基因，建議進(jìn)一步試驗(yàn)；Ⅲ類包括24份資源，其中4份來源于吉林省，20份來源于黑龍江省，相似系數(shù)為0.81～0.92，遺傳差異比較明顯。在相似系數(shù)為0.81（L2）處，可將Ⅰ類再 分為4個(gè)亞類：Ⅰ-a包括1份資源，為吉林；Ⅰ-b 包括18份資源，4份源于吉林省，其余來自黑龍江??；Ⅰ-c 包括五常紅七社和1號(hào)2份資源；Ⅰ-d 只有1份資源，為長(zhǎng)春。

2.3 農(nóng)藝性狀分析

農(nóng)藝性狀觀察結(jié)果見表3。利用表3中的表型性狀數(shù)據(jù)計(jì)算了材料間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，48份分蘗洋蔥材料間的遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.38～1.00，平均為0.64。利用上述農(nóng)藝性狀觀察結(jié)果構(gòu)建的聚類分析樹狀圖（圖3）表明：在遺傳相似系數(shù)為0.60 處可將48份材料分為3 類：Ⅰ類包括西林、獨(dú)頭等18份資源，其中5份來自吉林省；Ⅱ類包括28份資源，其中來自吉林省的內(nèi)蒙、吉林、農(nóng)安1、四六瓣、吉林2 等遺傳距離較近；Ⅲ類包括2份資源，4號(hào)和南方毛蔥。

圖2 48份分蘗洋蔥材料的ISSR 標(biāo)記聚類分析樹狀圖（UPGMA 法）

表3 48份分蘗洋蔥表型性狀觀察結(jié)果

續(xù)表

圖3 48份分蘗洋蔥材料的農(nóng)藝性狀聚類分析樹狀圖（UPGMA 法）

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定性高，不受樣品形態(tài)、基因表達(dá)與否及環(huán)境因子的限制（Joshi et al.，2000；Pradeep Reddy et al.，2002；Gupta et al.，2010；Tanya et al.，2011），且在蔥屬作物分類、進(jìn)化和遺傳多樣性的研究中應(yīng)用很多。梁景霞等（2008）應(yīng)用18個(gè)多態(tài)性引物對(duì)96份有代表性的煙草種質(zhì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，共獲得314條穩(wěn)定條帶，其中多態(tài)性條帶299條（占95.2%）。劉宏敏等（2011）以96份有代表性的韭菜資源為材料，進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)韭菜DNA 的ISSR 擴(kuò)增多態(tài)性比率達(dá)94.7%，認(rèn)為ISSR 是韭菜種質(zhì)資源研究的一種有效分子標(biāo)記。

品種間遺傳關(guān)系研究和遺傳多樣性分析對(duì)于分析作物育種具有十分重要的意義（Schut et al.，1997）。本試驗(yàn)以13條ISSR 引物對(duì)48份分蘗洋蔥材料共擴(kuò)增出132條條帶，其中多態(tài)性條帶109條，多態(tài)百分率（P）為82.6%，平均每條引物擴(kuò)增出10.15條條帶。供試48份分蘗洋蔥的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.59～0.94，其中賓縣1 和賓縣2、白城1 和雙城2 在分子水平上的遺傳相似系數(shù)達(dá)0.94，親緣關(guān)系較近，說明其可能是同物異名的品種；而南方毛蔥與其他資源的相似系數(shù)較小，在0.59～0.75 之間，可作為資源研究和育種的材料。ISSR 擴(kuò)增片段多態(tài)性較高，遺傳相似系數(shù)變幅較大，說明分蘗洋蔥在分子水平上遺傳多樣性較豐富。這可能是由于以下幾點(diǎn)原因：首先，分蘗洋蔥在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)不同的生態(tài)型，分化出了不同的種質(zhì)資源；其次，分蘗洋蔥為無性繁殖，不易發(fā)生變異，適應(yīng)外界環(huán)境條件差，只有遺傳基礎(chǔ)豐富的種質(zhì)才能存活下來；另外，由于過去對(duì)分蘗洋蔥研究的投入較少，育種目標(biāo)的定向選擇機(jī)會(huì)較少，多樣性性狀丟失也較少。

ISSR分子標(biāo)記的UPGMA 聚類結(jié)果表明，48份分蘗洋蔥種質(zhì)資源可分為三大類，與基于農(nóng)藝性狀的聚類結(jié)果基本一致。兩者均表明多數(shù)種質(zhì)資源之間的親緣關(guān)系與地理來源具有較大相關(guān)性，如來自黑龍江省的大部分種質(zhì)聚為一類，來自吉林省的四平和吉林2 聚為一類。但也有地理來源差距較大的種質(zhì)聚為一類，如白城1 和雙城2 聚在一起，這可能是近時(shí)間內(nèi)黑龍江省與吉林省之間分蘗洋蔥種質(zhì)資源的頻繁交流所致。但是，兩種方法的聚類結(jié)果也存在一些差別，這可能是由于ISSR 標(biāo)記體現(xiàn)的是種質(zhì)資源間分子水平上的差異，是遺傳因素的體現(xiàn)，而且檢測(cè)出的分子水平差異并不都與所觀測(cè)的農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)；而表型性狀的差異是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果（Eivazi et al.，2008）。另外，理想的分子標(biāo)記應(yīng)具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、遍布整個(gè)基因組、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快速、成本低廉、重復(fù)性好等要求。但是，目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均不能滿足以上所有要求。例如，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)（AFLP）具有最高的多態(tài)性檢測(cè)效率，但多態(tài)信息量不高；簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)（SSR）標(biāo)記具有多態(tài)性高，遺傳信息量大等優(yōu)點(diǎn)（Ali et al.，2008），如果AFLP位點(diǎn)能夠定位在SSR 遺傳連鎖圖譜上，那它將是非常有效的分子標(biāo)記（Haussmann et al.，2002；Geleta et al.，2006）。應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合SSR、AFLP等分子標(biāo)記方法進(jìn)行比較分析，從而更準(zhǔn)確地反映不同分蘗洋蔥種質(zhì)資源間的遺傳關(guān)系。

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