番茄黃化曲葉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

林 銘 胡 鴻 杜永臣 高建昌 王孝宣 國艷梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）屬于雙生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begomovirus），病毒基因組為單鏈環(huán)狀DNA，大小約為2.8 kb，病毒基因組含有4個(gè)ORFs（AC1、AC2、AC3和AC4）：AC1編碼的Rep 蛋白在開啟病毒環(huán)狀DNA 的滾環(huán)復(fù)制和選擇感染部位上起關(guān)鍵作用（Dasgupta et al.，2004；Selthet al.，2004）；AC2編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白（Transcriptional activator protein，TrAP）；AC3編碼與增強(qiáng)病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白（Replication enhancer，REn），可以加快病毒積累，增強(qiáng)病毒侵染及發(fā)病能力（Elmer et al.，1988；Sunter et al.，1990；Hormuzdi & Bisaro，1995）；AC4編碼的蛋白參與病毒的系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)或癥狀形成。TYLCV 主要通過煙粉虱（Bemisia tabaci）傳播。近年來，TYLCVD 在世界范圍大面積暴發(fā)，對番茄生產(chǎn)造成了毀滅性危害，成為世界許多地區(qū)番茄生產(chǎn)的重要限制因素（Polston et al.，2002；周雪平 等，2004；何自福 等，2007；Accotto & Noris，2007；國艷梅 等，2009；張愛紅 等，2011）。

對TYLCV 的檢測是深入研究其致病機(jī)制以及番茄抗病育種的基礎(chǔ)。早期，電鏡是唯一鑒定該病毒的檢測方法。生產(chǎn)上依靠觀察感病番茄植株的發(fā)病癥狀來確定是否帶毒，對無癥狀植株不能判斷帶毒與否。自TYLCV 被分離純化后，陸續(xù)建立了血清學(xué)、分子雜交和PCR檢測技術(shù)。熒光定量PCR檢測法是近年來發(fā)展起來的一種靈敏快速的病毒檢測方法，在病原真菌、細(xì)菌和病毒的檢測中的應(yīng)用已經(jīng)有報(bào)道（B?hm et al.，1999）。熒光定量PCR 技術(shù)，是指在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。為了準(zhǔn)確判斷樣品中某基因產(chǎn)物的起始拷貝數(shù)，熒光定量PCR 采用參數(shù)Ct值，C 代表循環(huán)（cycle），t 代表域值（threshold）。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。經(jīng)證明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小（趙煥英和包金風(fēng)，2007）。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)（陳旭 等，2010）。Mason 等（2008）采用熒光定量PCR 法對番茄植株中的TYLCV 進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)熒光定量PCR 法檢測TYLCV 的敏感度比膜雜交高2 200倍，可以用來檢測葉片中的少量病毒；Péréfarres等（2011）利用Taqman 探針法構(gòu)建熒光定量PCR 方法，利用侵染克隆的方法將分別含有TYLCVMld、TYLCV-IL 和PYMV（Potato yellow mosaic virus）的侵染克隆菌液接種到番茄植株中，在接種病毒后10、20、30 d，對番茄植株的病毒含量進(jìn)行檢測，研究不同雙生病毒的繁殖動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)雙基因組分的PYMV 繁殖得更快，病毒含量更高。

本試驗(yàn)根據(jù)番茄黃化曲葉病毒基因組中AC2 的保守序列設(shè)計(jì)引物，基于SYBR Green I 檢測模式，構(gòu)建了TYLCV 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 絕對定量檢測體系，以期為研究TYL CV 在番茄植株中的繁殖動(dòng)態(tài)、病毒與番茄植株的互作等方面打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 番茄感病材料9706，為無限生長型的粉果番茄育種材料，不含任何抗TYLCV 基因，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組提供；含TYLCV 基因組的侵染克隆由浙江大學(xué)周雪平教授惠贈(zèng)，該侵染克隆以TYLCV-IL[CN：SH2]分離物的番茄樣品總DNA 為模板，獲得含有1.4個(gè)重復(fù)SH2 全長基因組侵染克隆pBinPLUS-SH2-1.4A（張輝，2009），該侵染克隆含有兩個(gè)EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn)，如圖1所示。

BamH Ⅰ的酶切位點(diǎn)位于TYLCV 基因組的153位堿基處，EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)位于TYLCV基因組的1 800位堿基處。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 熒光定量PCR 的主要試劑：SYBR FAST qPCR Master Mix，購自北京閱微基因技術(shù)有限公司，含有實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需的dNTP、酶及染料。

普通PCR 的主要試劑：Promega 2×GoTaq Green Master Mix，購自北京澤平科技有限責(zé)任公司，包含普通PCR所需要的dNTP、Mg2+、酶等。

進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的主要儀器為羅氏熒光定量PCR 儀 LightCycler 480 Ⅱ。

圖1 TYLCV-IL[CN：SH2] 侵染克隆構(gòu)建流程（張輝，2009）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌（含侵染克?。┑呐囵B(yǎng) 取-80℃中保存的含侵染克隆的農(nóng)桿菌菌株（TYLCV-SH2），在添加了卡那霉素和利福平的固體LB 培養(yǎng)基（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）上劃平板，28℃培養(yǎng)2 d；菌落長出后挑單菌落于添加了卡那霉素和利福平的液體LB 培養(yǎng)基中（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）200 r·min-128℃培養(yǎng)過夜；以不加菌落的添加了卡那霉素和利福平的液體LB 培養(yǎng)基（Kan 50 mg·L-1+Rif 50 mg·L-1）作為對照，用分光光度計(jì)檢測菌液在600 nm 波長處的吸光值，當(dāng)吸光值達(dá)到0.6～0.8 之間時(shí)，該菌液可用于注射接種以及提取質(zhì)粒。

1.2.2 番茄植株的準(zhǔn)備 番茄種子用15%的次氯酸鈉溶液消毒12 min，無菌水清洗3次，28℃催芽48 h，播于預(yù)先用60 目紗網(wǎng)覆蓋的營養(yǎng)缽中。待植株2～4片真葉完全展開后接種病毒。接種前一天給番茄苗澆足水，接種時(shí)將長勢相同的番茄幼苗分為兩組，一組用一次性注射器（1 mL）吸取1 mL 菌液，去掉針頭，將菌液緩慢注射在番茄葉片背面葉脈之間的葉肉處，使菌液被植株充分吸收，如圖2所示；另一組作為對照，不接種。注射后適當(dāng)澆水，28℃/25℃（16 h/8 h）培養(yǎng)，30 d 左右番茄植株會(huì)出現(xiàn)典型癥狀。整個(gè)試驗(yàn)期間用60 目紗網(wǎng)覆蓋以杜絕外來病毒的感染。

圖2 注射接種侵染克隆

1.2.3 DNA 提取 接種30 d后，選取發(fā)病番茄植株頂部呈黃化卷曲癥狀的葉片以及對照組番茄植株的相同部位葉片，用常規(guī)CTAB 法（Mason et al.，2008）提取植株總DNA。用SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230 v型號的微量分光光度計(jì)測定總DNA 濃度后，將其稀釋為終濃度300 ng·μL-1，備用。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 張輝（2009）檢測了我國浙江、上海、山東、江蘇的感病番茄植株的TYLCV 分離物，發(fā)現(xiàn)均屬于上海類型，并構(gòu)建了含TYLCV-IL[CN：SH2]全基因組的侵染克隆。根據(jù)TYLCVIL[CN：SH2]的全基因組序列（AM282874.1），應(yīng)用Primer 5.00 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物（表1）（擴(kuò)增片段為基因AC2中的一段序列），由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，普通PCR 與熒光定量PCR 均采用這一對引物。

表1 TYLCV 檢測所設(shè)計(jì)引物

1.2.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系及條件 熒光定量PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1TySH_JC-F和TySH_JC-R各0.4 μL、DNA 1 μL、ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95℃，10 min；95℃，10 s，57℃，20 s，72℃，20 s，45個(gè)循環(huán)；95℃，5 s，65℃，1 min；40℃，10 s。

1.2.6 熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備（Mason et al.，2008） 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：取適量600 nm 波長吸光值在0.6～0.8 之間的菌液，用北京博邁德生物技術(shù)有限公司的高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒按試劑盒的操作說明提取質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，然后用SHIMADZU 公司的BioSpec-nano/230 v型號的微量分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度，用下列公式計(jì)算拷貝數(shù)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

質(zhì)粒拷貝數(shù)/μL=（C×10-9）×（6.02×1023）/（質(zhì)粒堿基數(shù)×660 dalton/bp）

C表示質(zhì)粒濃度，單位ng·μL-1；

每個(gè)侵染克隆含有1.4個(gè)TYLCV 全基因組，每個(gè)TYLCV 全基因組含2 781 bp。

用獲得的健康番茄的DNA 溶液以10倍梯度稀釋質(zhì)粒，計(jì)算每個(gè)梯度所含質(zhì)粒的濃度和拷貝數(shù)。然后進(jìn)行熒光定量PCR，獲得不同梯度與Ct值之間的關(guān)系，得到質(zhì)粒濃度及拷貝數(shù)以10為底的對數(shù)與Ct值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 番茄植株中TYLCV含量的測定（Mason et al.，2008；Péréfarres et al.，2011） 根據(jù)熒光定量PCR 反應(yīng)體系及條件，以稀釋好的番茄總DNA 和稀釋成不同梯度的質(zhì)粒為模板，利用熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)完成后用最大二階導(dǎo)數(shù)法對結(jié)果進(jìn)行分析獲得絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取樣品中病毒的拷貝數(shù)，完成定量。

1.2.8 普通PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 普通PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×GoTaq Green Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1TySH_JC-F 和TySH_JC-R 各0.5 μL，DNA 1 μL、ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 90 s，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳后染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株中TYLCV 絕對定量

用最大二階導(dǎo)數(shù)法對7個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行絕對定量分析，計(jì)算獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，即Ct=-3.487×log 拷貝數(shù)+43.21，效率值為1.975。本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

根據(jù)1.2.7 的TYLCV 的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，測定發(fā)病番茄植株中TYLCV 的含量。結(jié)果見表2。

檢測發(fā)現(xiàn)接種病毒的番茄植株中含有的病毒拷貝數(shù)基本相同，1 ng·μL-1的感病番茄DNA 中約含有3.47×106個(gè)病毒拷貝。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 絕對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 發(fā)病番茄植株中TYLCV 絕對含量

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 與普通PCR 靈敏度比較

將獲得的菌液質(zhì)粒用健康番茄DNA 以10倍梯度稀釋，獲得若干個(gè)梯度的樣品，按1.2.5及1.2.6 的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測及普通PCR檢測，結(jié)果顯示：實(shí)時(shí)熒光定量PCR能檢測到106倍稀釋液，最低濃度的稀釋液仍可以用來計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示；而普通PCR 只能檢測到104倍稀釋液，105倍稀釋液電泳條帶不清晰，如圖5所示。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測比普通PCR檢測的靈敏度約高100倍。

圖4 TYLCV 熒光定量PCR檢測靈敏度

圖5 TYLCV 普通PCR檢測靈敏度

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的TYLCV 特異性檢測引物不僅可以用于普通PCR檢測TYLCV，還可以應(yīng)用于熒光定量PCR 對TYLCV 進(jìn)行絕對定量檢測，并且本試驗(yàn)通過比較普通PCR 與熒光定量PCR 的靈敏度，發(fā)現(xiàn)后者的靈敏度比前者高100倍，采用熒光定量PCR 方法可以檢測到微量病毒。

目前國內(nèi)外在TYLCV 的抗源篩選等方面做了大量工作。育種者對野生番茄的抗TYLCV 篩選結(jié)果表明，在醋栗番茄、秘魯番茄、智利番茄、多毛番茄及契斯曼尼番茄中均存在抗病基因，抗病基因主要有Ty-1（Zamir et al.，1994）、Ty-2（Hanson et al.，2006）、Ty-3（Ji et al.，2007）、Ty-4（Ji et al.，2009）和Ty-5（Anbinder et al.，2009）。

上述抗病基因均為不完全顯性基因，TYLCV 均可在含有上述基因的體內(nèi)存活。盡管有研究表明TYLCV 在抗病番茄中的含量低于感病番茄（Ayed et al.，2010），但也有研究認(rèn)為TYLCV含量在抗/感材料間并無絕對的差異（張輝，2009）。熒光定量PCR 的高靈敏度為準(zhǔn)確研究病毒在不同抗性材料中的含量提供了技術(shù)可能。采用本試驗(yàn)所述的TYLCV 的熒光定量PCR檢測方法，可以深入研究不同抗性基因的抗性機(jī)制，有助于深入研究番茄與TYLCV 之間的互作以及整合不同抗性基因來選育抗TYLCVD 的優(yōu)良番茄新品種。

本試驗(yàn)建立了一種TYLCV含量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該方法能有效檢測接種病毒侵染克隆后番茄植株中病毒的絕對含量，1 ng·μL-1感病番茄中DNA 約含有3.47×106個(gè)病毒拷貝。本試驗(yàn)僅對接種的侵染克隆進(jìn)行了定量分析，盡管所設(shè)計(jì)的引物來自于病毒基因組序列，但仍需對生產(chǎn)中TYLCVD 發(fā)病株進(jìn)行驗(yàn)證，以明確其有效性。同時(shí)，進(jìn)行熒光定量PCR所需的儀器及藥品較為昂貴，難以普及。對病毒的簡單驗(yàn)證可以用本試驗(yàn)所提供的引物序列進(jìn)行。

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