宋勇強(qiáng),贠建民,安志剛,韓慶輝
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州730070)
涼州熏醋是甘肅名優(yōu)產(chǎn)品,是在借鑒山西陳醋釀造技術(shù)的基礎(chǔ)上,結(jié)合當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件通過工藝改造而形成的獨(dú)特工藝[1]。其釀造歷程是物料在各種無機(jī)、有機(jī)和生物復(fù)合體相互作用下的復(fù)雜反應(yīng)過程,其中微生物作為發(fā)酵的源動(dòng)力,是促使物質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵,而與食醋產(chǎn)量品質(zhì)關(guān)系最密切的核心微生物就是典型優(yōu)勢(shì)醋酸菌[2]。醋酸菌發(fā)酵條件作為一個(gè)多變量系統(tǒng),該過程涉及活細(xì)胞體,周圍環(huán)境的微小變化都會(huì)引起微生物的不同生理反應(yīng),從而使代謝過程更趨于復(fù)雜,使整個(gè)產(chǎn)酸系統(tǒng)呈現(xiàn)高度的非線性和時(shí)變性,因此很難通過準(zhǔn)確的數(shù)學(xué)模型找出使指標(biāo)達(dá)到最佳值的因素水平組合[3]。在模型建立中,人們對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(Artificial Neural Network,ANN)的興趣日益增加。而應(yīng)用最廣泛的網(wǎng)絡(luò)是采用誤差反向傳播算法前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP網(wǎng)絡(luò))[4]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型與傳統(tǒng)的回歸模型相比表現(xiàn)出了較高的預(yù)測(cè)精度[5]。James S等[6]對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和響應(yīng)曲面法進(jìn)行了比較,結(jié)果表明人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比響應(yīng)曲面法好。一些研究人員已經(jīng)將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)成功應(yīng)用于食品與發(fā)酵領(lǐng)域,如建模與控制[7-8]、加工與預(yù)測(cè)[9-10]和條件優(yōu)化[11-12]等。為此,本實(shí)驗(yàn)以甘肅涼州熏醋傳統(tǒng)釀造醋醅中分離出的一株高產(chǎn)酸醋酸菌A3作為出發(fā)菌株,采用正交設(shè)計(jì)與ANN模型相結(jié)合的方法優(yōu)化其醋酸發(fā)酵條件,旨在為指導(dǎo)食醋生產(chǎn)提供一定的依據(jù)和參考。
1.1 材料與儀器
A3菌株 為Acetobacter pomorum,由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室從甘肅涼州熏醋傳統(tǒng)釀造醋醅中分離得到;無水葡萄糖 分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;碳酸鈣、瓊脂粉 均為分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;乙醇、氫氧化鈉 均為分析純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;酵母膏、酚酞指示劑 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
斜面培養(yǎng)基 無水葡萄糖1.5%,酵母膏1%,碳酸鈣2%、瓊脂2%,pH自然,滅菌后溫度降至70℃左右加入無水乙醇4%(V/V);種子培養(yǎng)液:挑取一環(huán)經(jīng)30℃培養(yǎng)12h活化的斜面菌種,接種于20m L/ 250m L三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、150 r/m in振蕩培養(yǎng)30h;發(fā)酵培養(yǎng)基:無水葡萄糖1.5%,酵母膏1%,pH自然,滅菌后溫度降至70℃左右加入無水乙醇3%(V/V)。
YX-280A型手提式不銹鋼蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;HG303-4A電熱恒溫培養(yǎng)箱北京市光明醫(yī)療儀器廠;THZ-82N臺(tái)式恒溫振蕩器 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;pHS-3C型酸度計(jì)上海佑科儀器儀表有限公司;DH-600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱 北京科委永興儀器有限公司;SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;XSP-C型生物顯微鏡 北京瑞宏誠科技發(fā)展有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;FA1204B型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司。
1.2 產(chǎn)酸量測(cè)定
量取20m L蒸餾水加入250m L三角瓶中,加酚酞指示劑2滴,將1m L發(fā)酵液加入三角瓶中,搖勻后用堿式滴定法測(cè)定產(chǎn)酸量(以醋酸計(jì)),按公式1計(jì)算:
式中:C-0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液;V-發(fā)酵后樣品滴定NaOH消耗量,m L;V0-發(fā)酵前樣品滴定NaOH消耗量,m L;60.06-醋酸的摩爾質(zhì)量,g/mol。
1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計(jì)
1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.3.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響 將活化的醋酸菌A3接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在以下條件進(jìn)行揺瓶發(fā)酵:接種量10%,乙醇濃度4%,pH5.0,搖床轉(zhuǎn)速150 r/m in,發(fā)酵時(shí)間6d,發(fā)酵溫度分別設(shè)為24、26、28、30、32、34、36℃。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。
1.3.1.2 乙醇濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響 在篩選的最佳溫度及在其他發(fā)酵條件同1.3.1.1的前提下,將乙醇濃度分別設(shè)為2%、4%、6%、8%、10%、12%,進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。
1.3.1.3 初始pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響 在篩選的最佳溫度和乙醇濃度下,控制接種量 10%,搖床轉(zhuǎn)速150 r/m in,發(fā)酵時(shí)間6d,并將初始pH分別設(shè)為3、4、5、6、7、8、9。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。
1.3.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量的影響 在上述篩選的最佳條件下,分別測(cè)定1~8d內(nèi)不同發(fā)酵時(shí)間段的產(chǎn)酸量,以確定最佳發(fā)酵周期。
1.3.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸量的影響 在上述篩選的最佳條件下,控制接種量10%,發(fā)酵時(shí)間8d,搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100、125、150、175、200 r/m in。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸量。
1.3.2 正交設(shè)計(jì) 采用L16(45)正交設(shè)計(jì),以發(fā)酵液產(chǎn)酸量為指標(biāo),將菌種活化12h,在接種量10%,轉(zhuǎn)速150 r/m in的條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),考察初始乙醇濃度、發(fā)酵溫度、起始pH及發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸量的影響,實(shí)驗(yàn)因素及水平見表1。
表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal test
1.3.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立 在正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上建立BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,利用正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為對(duì)BP網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練樣本。在學(xué)習(xí)和訓(xùn)練過程中,通過調(diào)節(jié)連接權(quán)值和閾值使網(wǎng)絡(luò)達(dá)到預(yù)期的誤差范圍內(nèi),并用另外兩組數(shù)據(jù)17號(hào)和18號(hào)來檢驗(yàn)?zāi)P偷姆夯芰Α_\(yùn)用建立好的網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真,得出醋酸菌最佳發(fā)酵條件。
2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1.1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響 由圖1可知,隨著發(fā)酵溫度的升高,發(fā)酵液的醋酸含量先增加后降低。30℃時(shí)產(chǎn)酸最高,當(dāng)發(fā)酵溫度超過32℃后產(chǎn)酸量開始下降。這是由于發(fā)酵過程中,發(fā)酵溫度過高使菌體老化加快,而溫度過低時(shí),不利于醋酸菌的生長,產(chǎn)酸量也低。所以在做正交實(shí)驗(yàn)時(shí)宜選用28、30、32、34℃。
圖1 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the content of acetic acid
2.1.2 乙醇濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響 由圖2可知,當(dāng)發(fā)酵液中的乙醇濃度為4%左右時(shí)醋酸含量最高,但是隨著乙醇濃度的增大,產(chǎn)酸量卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度達(dá)到12%時(shí)產(chǎn)酸量僅為0.6189g/100m L,其原因可能是當(dāng)發(fā)酵液中的乙醇含量較低時(shí),醋酸菌的作用底物不足,產(chǎn)酸量也就相應(yīng)的較低;當(dāng)發(fā)酵液中的乙醇含量過高時(shí),雖然理論上可以為醋酸菌提供較多的作用底物,但是高濃度的乙醇會(huì)對(duì)醋酸菌的發(fā)酵活力產(chǎn)生抑制作用[13]。因此選用乙醇濃度為2%、4%、6%、8%。
圖2 乙醇濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.2 Effect of concentration of alcohol on the content of acetic acid
2.1.3 pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響 由圖3可知,隨著發(fā)酵液初始pH的升高,發(fā)酵液的醋酸含量呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢(shì)。在pH6.0附近產(chǎn)酸量達(dá)到最大值,之后隨著發(fā)酵液pH的增大產(chǎn)酸量開始大幅度降低。這是由于醋酸菌的最適生長pH為5.5~6.5,過高或過低都不利于醋酸菌生長;另外一般微生物體內(nèi)的酶,其最適pH多在5.5~8.0之間[14],因此做正交實(shí)驗(yàn)時(shí)選用pH為4、5、6、7。
圖3 pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of pH value on the content of acetic acid
2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量的影響 由圖4可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,醋酸菌產(chǎn)酸量呈現(xiàn)遞增趨勢(shì),前5d產(chǎn)酸量增大趨勢(shì)明顯,從第5d開始,發(fā)酵液中的醋酸含量增勢(shì)趨緩,并在第8d時(shí)達(dá)到最大。因此宜選用發(fā)酵時(shí)間為5、6、7、8d。
2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸量的影響 醋酸菌是一種專性好氧菌,根據(jù)醋酸菌的生命代謝活動(dòng)規(guī)律,除了需要豐富的營養(yǎng)物質(zhì)外還必須有足夠的氧氣供應(yīng)[15],而發(fā)酵液中的溶解氧與搖床轉(zhuǎn)速有關(guān)。由圖5可知,在供試搖床轉(zhuǎn)速范圍內(nèi),發(fā)酵液中的醋酸含量隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大而升高,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/m in時(shí),產(chǎn)酸量達(dá)到最大,但之后隨著搖床轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增大產(chǎn)酸量趨于穩(wěn)定。其原因是當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r/m in時(shí),發(fā)酵液中的溶液氧已經(jīng)能夠滿足醋酸菌的生長需求,即達(dá)到了溶解氧的供需平衡。因此在之后的正交實(shí)驗(yàn)時(shí)將搖床轉(zhuǎn)速確定為150 r/m in。
圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the content of acetic acid
圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the concent of acetic acid
2.2 正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定出4種主要影響醋酸菌產(chǎn)酸的因素[16],按照正交表設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),表2中17號(hào)和18號(hào)實(shí)驗(yàn)作為檢驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)泛化能力的數(shù)據(jù)不屬于正交設(shè)計(jì)范圍內(nèi),結(jié)果見表2。
表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Results of orthogonal test
表4 最優(yōu)組合下A3菌株的產(chǎn)酸量Table4 The yield of acetic acid under optimal combination of bacterial strain A3
由表3極差分析結(jié)果可知:在實(shí)驗(yàn)取值范圍內(nèi),影響因素中對(duì)產(chǎn)酸量影響最大的是乙醇濃度(R= 1.987),其次是發(fā)酵時(shí)間(R=1.526),再次是pH(R=0.721),而對(duì)產(chǎn)酸量影響最小的是發(fā)酵溫度(R=0.581)。從極差分析表中可以得出每個(gè)因素的最佳水平,將其組合在一起即為最優(yōu)組合:乙醇濃度4%、發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.0和發(fā)酵時(shí)間8d。
表3 極差分析Table3 Analysis of range
綜上所述,由于在表2正交實(shí)驗(yàn)中得出的最高產(chǎn)酸量的發(fā)酵條件為:乙醇濃度4%、溫度30℃、起始pH4.0、發(fā)酵時(shí)間8d,產(chǎn)酸量達(dá)到3.6129g/100m L;而在極差分析結(jié)果中得出的最優(yōu)組合為乙醇濃度4%、發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間8d,二者不一致,故有必要通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較,即在乙醇濃度4%、發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間8d的條件下開展醋酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn),測(cè)定該醋酸菌A3菌株的產(chǎn)酸量,重復(fù)測(cè)定6次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4得出在最優(yōu)組合即乙醇濃度4%、發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間8d的條件下,醋酸菌 A3菌株的產(chǎn)酸量平均值為 3.9089g/ 100m L。顯然在該最優(yōu)組合下A3菌株的產(chǎn)酸量要明顯高于在正交表2中得出的最高產(chǎn)酸量。故得出最佳發(fā)酵條件為:乙醇濃度4%、溫度30℃、起始pH6.0、發(fā)酵時(shí)間8d。
通過表5方差分析可以得出供試溫度范圍對(duì)產(chǎn)酸量的影響不顯著,而初始乙醇濃度、起始pH和發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量均有顯著影響。因而,除去溫度因素,以其他三個(gè)因素的水平分別作橫坐標(biāo),產(chǎn)酸量為縱坐標(biāo),做出因素與產(chǎn)酸量的關(guān)系圖,結(jié)果見圖6~圖7。
表5 方差分析Table5 Analysis of variance
從圖6可知,在乙醇濃度4%和起始pH6.0附近,A3菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸量最大;由圖7可知,隨著發(fā)酵時(shí)間延長,產(chǎn)酸量呈增大趨勢(shì),在本實(shí)驗(yàn)供試條件下,8d產(chǎn)酸量最大。
綜上所述,根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析所得出的最優(yōu)組合即初始乙醇濃度4%、起始pH6.0和發(fā)酵時(shí)間8d為最佳發(fā)酵條件,但不一定是全局最佳發(fā)酵條件,有可能在乙醇濃度4%和起始pH6.0附近存有更好的發(fā)酵條件,因此,本實(shí)驗(yàn)在首先確定發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間兩因素的最佳水平為30℃和8d的基礎(chǔ)上,擬通過引入人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的仿真模擬去尋找更精確的發(fā)酵條件。
圖6 乙醇濃度和pH對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of concentration of alcohol and pH value on the content of acid
圖7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酸量的影響Fig.7 Effect of fermentation time on the content of acid
2.3 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立、仿真及優(yōu)化分析
本實(shí)驗(yàn)建立三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),三層網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)由輸入層、隱含層和輸出層組成。利用Matlab7.0神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱,隨機(jī)選取正交實(shí)驗(yàn)中的14組因素水平組合作為輸入樣本,數(shù)據(jù)見表2,用產(chǎn)酸量結(jié)果作為相應(yīng)輸入樣本所對(duì)應(yīng)導(dǎo)出信號(hào),輸入向量P與目標(biāo)向量T見圖8(1)和圖8(2)。由于輸入層和輸出層的節(jié)點(diǎn)數(shù)已確定,所以隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)的選取將會(huì)影響網(wǎng)絡(luò)模型的性能,通過調(diào)整隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)和訓(xùn)練次數(shù),使網(wǎng)絡(luò)性能函數(shù)均方誤差MSE達(dá)到工作要求(goal=0.0001),三層BP網(wǎng)絡(luò)模型建立成功,輸入層4個(gè)節(jié)點(diǎn),隱含層5個(gè)節(jié)點(diǎn),輸出層1個(gè)節(jié)點(diǎn),節(jié)點(diǎn)傳遞函數(shù)為單極性的Sigmoid函數(shù),見圖8。
將實(shí)驗(yàn)值與仿真值進(jìn)行了比較[17],見圖9,結(jié)果顯示出網(wǎng)絡(luò)模型具有很好的仿真性能。用建立好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)第17組和第18組數(shù)據(jù)進(jìn)行仿真模擬,結(jié)果見表2,仿真模擬結(jié)果表明網(wǎng)絡(luò)有較好的泛化能力,相對(duì)誤差小于0.5%,達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。
圖8 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig.8 Architecture of ANN
圖9 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型仿真Fig.9 Simulation of ANN mold
根據(jù)2.2正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析,確定發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間為30℃和8d,將pH固定為6.0,運(yùn)用建立好的網(wǎng)絡(luò)模型在初始乙醇濃度4%附近進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真,結(jié)果見圖10。從圖10中得出初始乙醇濃度4.2%為最佳濃度;在乙醇濃度4.2%、溫度30℃和發(fā)酵時(shí)間8d的條件下,應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)模型在pH6.0附近進(jìn)行數(shù)據(jù)仿真,結(jié)果見圖11。從圖11中得出pH6.4為最佳起始pH。至此,得出最佳發(fā)酵條件為:乙醇濃度4.2%、發(fā)酵溫度30℃、初始pH6.4、發(fā)酵時(shí)間8d。通過模型仿真得出產(chǎn)酸量為4.3234g/100m L,最佳發(fā)酵條件下的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酸量為4.3086g/100m L。
圖10 乙醇濃度3%~5%對(duì)產(chǎn)酸量影響的仿真結(jié)果Fig.1 0 The simulation result of effect of concentration of alcohol 3%~5%on the content of acetic acid
3.1 從正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)組合為初始乙醇濃度4.0%、發(fā)酵溫度30℃、pH6.0、發(fā)酵時(shí)間8d,此發(fā)酵條件下產(chǎn)酸量為3.9089g/100m L,但由于這種尋優(yōu)方法只是通過少量實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到尋找最優(yōu)組合,因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定的局部性。
圖11 pH5~7對(duì)產(chǎn)酸量影響的仿真結(jié)果Fig.1 1 The simulation result of effect of pH value 5~7 on the content of acetic acid
3.2 運(yùn)用BP網(wǎng)絡(luò)模型在正交實(shí)驗(yàn)分析基礎(chǔ)上仿真計(jì)算尋找得出最佳醋酸發(fā)酵條件為初始乙醇濃度4.2%(v/v)、發(fā)酵溫度30℃、起始pH6.4、發(fā)酵時(shí)間8d,BP網(wǎng)絡(luò)模型仿真產(chǎn)酸量達(dá)到最高 4.3234g/ 100m L,此條件下的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)酸量為4.3086g/100m L,相比正交實(shí)驗(yàn)所得最佳發(fā)酵條件下的產(chǎn)酸量提高了10.23%,尋找到了因素水平內(nèi)的全局最佳組合,為醋酸發(fā)酵尋找到了精確的控制條件。
因此,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了采用正交設(shè)計(jì)與ANN模型相偶聯(lián)的優(yōu)化方法在食品與發(fā)酵領(lǐng)域條件優(yōu)化研究方面具有其優(yōu)越性。用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為數(shù)據(jù)信息,結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)“黑箱”的特點(diǎn),可使復(fù)雜的發(fā)酵多變量體系變成易于模擬和預(yù)測(cè)的模型,可方便地對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。
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