HPLC法測定云南省不同辣椒品種中辣椒堿及二氫辣椒堿的含量

劉 錄，陳海云，劉菲菲，姚元成，徐勝平，楊克沙，趙海云，曹建新，*

(1.昆明理工大學化學工程學院，云南昆明 650504;2.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明 650500)

辣椒(Capsicum frutescence L.)又稱辣角、辣子、番椒、秦椒，屬茄科辣椒屬植物，是人類種植的最古老的農(nóng)作物之一［1］，它具有體溫調節(jié)［2］、抗癌［3］，消炎鎮(zhèn)痛［4］等作用，不僅可以作為調味品來使用，還可作為菜肴來食用，許多人很喜歡食用。辣椒中具有辣味的物質有十余種，其中辣椒堿(Capsaicin)、二氫辣椒堿(Dihydrocapsaicin)是最辣的成分，這兩種物質的含量約占辣椒中辣味物質的90%左右。辣味物質含量越高，辣椒的辣味越強［5－6］。云南地處低緯高原地區(qū)，地理位置特殊，地形地貌復雜，海拔懸殊極大，各地氣候受海拔和地形影響大于緯度影響，往往同一地區(qū)出現(xiàn)不同氣候帶，全省具有豐富多樣的氣候類型。這種復雜多樣的地理環(huán)境和氣候條件，分布有大量的辣椒種質資源，是我國辣椒種質資源最為豐富的省份之一［7］。據(jù)此，本文通過高效液相的分析方法對云南省不同地區(qū)不同品種的辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量進行分析檢測，擬建立一種快速、準確、高效的分析檢測方法及為從植物資源中提取辣椒堿類物質提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣椒樣品采于云南省紅河、河口、丘北、景洪、江那和德宏地區(qū)，經(jīng)云南省農(nóng)科院園藝所劉發(fā)萬副研究員鑒定;液相標品:二氫辣椒堿，辣椒堿(純度均≥98%) 購于成都曼斯特生物科技有限公司。

PE Series 200 LC高效液相色譜儀 美國珀金埃爾默公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;SB－2000 EYELA旋轉蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒－托利多上海有限公司。

無水乙醇、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃和磷酸 均為分析純，購于天津市風船化學試劑科技有限公司;甲醇和乙腈 均為色譜純，購于江蘇漢邦科技有限公司;純凈水 購于杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品溶液的提取 對樣品進行超聲提?。?］，通過單因素實驗確定實驗的溶劑、提取溫度、液固比和超聲時間四個因素，并以此為據(jù)按照因素水平表1進行四因素三水平的L9(34)正交實驗，得到最佳提取條件，液固比:30∶1;提取溶劑:75%乙醇水溶液;提取溫度:55℃;超聲時間:50min。

表1 因素水平表Table1 The table of the factors and levels

1.2.2 對照品溶液的配制 取辣椒堿和二氫辣椒堿適量，置于干燥器中過夜干燥，精密稱定各化合物，用甲醇配制成單品對照品溶液和混合對照品溶液。

1.2.3 樣品溶液的配制

1.2.3.1 干辣椒樣品溶液的制備［9］將干辣椒在50℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩，稱取1.0000g于100mL容量瓶中加入30mL乙醇，用保鮮膜封口，用針扎幾個小孔，經(jīng)超聲波清洗儀于55℃下超聲提取50min，用濾紙過濾后，收集濾液，將濾渣和濾紙重新加入75%乙醇溶液25mL，超聲提取20min，再重復1次，將三次過濾收集的濾液合并，用旋轉蒸發(fā)儀在70℃下濃縮，甲醇定容至25mL，經(jīng)0.45μm膜過濾，待測。

1.2.3.2 新鮮辣椒樣品溶液的制備［9］新鮮辣椒用組織搗碎機搗碎，稱取5.0000g，用烘箱在50℃下烘干至恒重。制備方法同上節(jié)所述干辣椒樣品溶液的制備方法。

1.2.4 色譜條件(樣品溶液的提取;色譜條件) 色譜柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)。檢測器:紫外檢測器。檢測波長:280nm。柱溫:30℃。甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65% ～90%，0～30min)，流速 1.2mL/min。進樣量20μL。

1.2.5 計算公式 辣椒堿、二氫辣椒堿得率為提取的辣椒堿和二氫辣椒堿的質量與辣椒樣品質量的比值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溶劑的選擇 根據(jù)“相似相容”原理，結合辣椒堿及二氫辣椒堿的結構及極性，實驗選擇甲醇、丙酮、乙酸乙酯、四氫呋喃、50%乙醇、70%乙醇和無水乙醇7種溶劑進行提取。結果表明相同條件下，甲醇對辣椒堿和二氫辣椒堿的提取得率最高，四氫呋喃(THF)次之，70%乙醇溶液與THF相比略有下降，丙酮最低。但鑒于毒性和價格綜合考慮，選擇乙醇作為提取劑較適宜。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)的選擇 2.1.1中，當乙醇體積分數(shù)不同時，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率差別較大，為了找到更適宜提取的乙醇體積分數(shù)，進一步提高得率，實驗選取體積分數(shù)為50%～100%的乙醇，相鄰間距為10%，重復2.1.1的提取操作，結果表明辣椒堿和二氫辣椒堿的得率與乙醇體積分數(shù)呈拋物線變化，在乙醇體積分數(shù)在80%附近時，達到最大。因此實驗選擇80%的乙醇為提取劑。

2.1.3 提取溫度的選擇 實驗中精確稱取等質量的辣椒樣品，加入25mL濃度為80%的乙醇溶液，分別在30～70℃下，相鄰間距為 10℃，超聲輔助提取30min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至 25mL，取適量過0.45μm濾膜，進行HPLC測定。結果表明辣椒堿和二氫辣椒堿的得率與超聲溫度呈拋物線變化，50℃附近提取率都達到最大，因此，辣椒堿的提取溫度控制在50℃左右為宜。

2.1.4 液固比的選擇 實驗中精確稱取等質量的辣椒樣品，分別按取液固比(體積:質量)為 10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入濃度為 80% 的乙醇，在 50℃ 下超聲輔助提取30min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至25mL，取適量過0.45μm濾膜，進行HPLC測定。結果表明隨著液固比的增大，相間傳質速率增大，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率不斷增大，當液固比為25∶1后，得率變化不大，綜合考慮最佳的提取液固比應為25∶1。

2.1.5 超聲時間的選擇 實驗中精確稱取等質量的辣椒樣品，按液固比(V:m)為25∶1加入濃度為80%的乙醇，在50℃下分別超聲輔助提取20、30、40、50、60min，經(jīng)抽濾、濃縮后定容至 25mL，取適量過0.45μm濾膜，進行HPLC測定。結果表明超聲時間由20min升至30min過程中，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率迅速升高，提取時間繼續(xù)增長，得率變化不大，因此超聲提取時間確定為30min左右為宜。

2.2 正交實驗

在單因素實驗基礎上，選取影響辣椒堿和二氫辣椒堿得率的乙醇體積分數(shù)、提取溫度、液固比和超聲時間4個因素，設計四因素三水平的L9(34)正交實驗，來進一步優(yōu)化辣椒堿和二氫辣椒堿的提取工藝，正交實驗結果及分析見表2。

由表2可見，以辣椒堿和二氫辣椒堿得率分別為指標時，適宜提取工藝都為:A1B3C3D3，由正交分析知其最優(yōu)條件均為A1B3C3D3，與正交實驗分析所得最優(yōu)工藝條件一致，所以選擇A1B3C3D3為辣椒堿和二氫辣椒堿得率的適宜提取工藝條件，即乙醇濃度為75%、提取溫度為55℃、液固比為30∶1、超聲時間為50min。

表2 正交實驗結果Table2 The results of orthogonal experiment

表3 標準曲線、檢出限及定量限實驗結果Table3 Results of standard curve，detection limit and quantitation limit

2.3 超聲提取次數(shù)的確定

精確稱取等質量的辣椒樣品5份，參照以上得出的辣椒堿和二氫辣椒堿適宜提取工藝分別提取1～5次，HPLC分析結果表明當對辣椒樣品進行重復提取時，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率有很大升高，但隨著提取次數(shù)的增加到3次時，辣椒堿和二氫辣椒堿的得率升高不明顯，表示辣椒堿和二氫辣椒堿已經(jīng)接近完全提取，考慮工藝復雜性及經(jīng)濟性，選擇提取次數(shù)為3次。

2.4 色譜分離參數(shù)的確定

2.4.1 檢測波長的確定 采用雙光束紫外可見光光度計對辣椒堿和二氫辣椒堿進行掃描，掃描波長范圍為190～400nm，辣椒堿和二氫辣椒堿均在 λ=280nm處有最大吸收峰，與文獻值一致。所以，選擇檢測波長λ=280nm，對辣椒堿及二氫辣椒堿進行HPLC檢測。

2.4.2 流動相的確定 為了獲得較好的分離度，通過查閱文獻，實驗中利用8組不同流動相系統(tǒng):乙腈－水，乙腈－1‰磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－2.5%乙酸水溶液，甲醇－1‰甲酸水溶液，甲醇－3‰甲酸水溶液，甲醇－1‰磷酸水溶液，甲醇－3‰磷酸水溶液，甲醇－水－磷酸。分別對樣品中化合物含量進行測定，通過比較化合物保留時間和峰型，最終選用甲醇－3‰磷酸水溶液系統(tǒng)。將供試品溶液經(jīng)HPLC進行分析，結果顯示:甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65%～90%，0～30min)，辣椒堿和二氫辣椒堿可獲得較好的分離度。

2.5 對照品液和樣品液的色譜分離圖

取供試樣品溶液適量，參照上面所述液相方法進行HPLC分析，記錄譜圖，如圖1所示。供試品色譜圖中辣椒堿和二氫辣椒堿的色譜峰分離度及峰形均較好，符合高效液相色譜定量分析的一般要求。

分別取辣椒堿和二氫辣椒堿對照品溶液適量，參照上面同樣的液相方法進行HPLC分析，記錄譜圖，如圖1所示。辣椒堿和二氫辣椒堿在色譜圖中的保留時間分別為13.2、16.4min，取供試樣品溶液2份，分別加入辣椒堿和二氫辣椒堿對照品溶液，搖勻，各取適量經(jīng)0.45μm膜過濾，經(jīng)HPLC分析，譜圖中對應的色譜峰明顯增高。

圖1 混合對照品與樣品對照色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatogram of reference substances and samples

2.6 線性關系、定量限及檢出限的考察

精密稱取辣椒堿、二氫辣椒堿各25.02mg，分別定容至25mL，都配制成濃度為1mg/mL的標準液，用甲醇對標準液進行不同倍數(shù)的稀釋使?jié)舛确謩e為0.20、0.10、0.08、0.05、0.02mg/mL。經(jīng) HPLC 分析，以對照品的峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果見表3所示。辣椒堿和二氫辣椒堿在各自的線性范圍內線性關系良好，線性相關系數(shù)均達到0.999以上。

取各單品對照品溶液，用甲醇稀釋后進行HPLC分析，調整溶液濃度得出信噪比為3和10時，即可得到樣品的最低檢出限和定量限，辣椒堿和二氫辣椒堿的檢出限和定量限，結果見表3所示。

2.7 精密度及穩(wěn)定性實驗

取適量配制好的混合對照品溶液，用0.45μm濾膜微過濾后進行HPLC分析，連續(xù)進樣6次，辣椒堿和二氫辣椒堿兩種對照品HPLC分析結果相對標準偏差RSD分別為0.46%和0.79%，表明儀器精密度良好，該方法精密度符合要求。

表7 新鮮辣椒中辣椒堿，二氫辣椒堿含量Table7 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in fresh chillies

表8 干辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿含量Table8 The content of capsaicin and dihydrocapsaicin in dry chillies

2.8 重復性實驗

取同一供試樣品溶液，平行測定6次，考察HPLC測定的重復性，結果見表4，辣椒堿和二氫辣椒堿的相對標準偏差分別為0.57%和0.86%，符合實驗要求。

表4 色譜方法穩(wěn)定性實驗結果Table4 Stability of the experimental results of chromatographic methods

2.9 穩(wěn)定性實驗

取某一樣品溶液，每2h經(jīng)HPLC測定一次，測定結果見表5所示。辣椒堿和二氫辣椒堿的相對標準偏差分別為0.54%和0.63%，表明樣品在10個小時內穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率實驗

采用加樣回收法，取涮涮辣樣品，設計5組平行實驗，每組三份分別加入0.10、0.30、0.50mL辣椒堿和二氫辣椒堿對照品儲備液，記錄峰面積，按線性回歸方程計算辣椒堿和二氫辣椒堿的含量，數(shù)據(jù)結果表明，平均加標回收率在98.58%～99.81%，相對標準偏差為0.47%～0.99%。表明該方法可以滿足對辣椒樣品的分析測試要求?；厥章屎拖鄬藴势钜姳?。

表5 樣品穩(wěn)定性實驗結果Table5 Experimental results of the sample stability

表6 添加回收率的結果(n=5)Table6 Results of recovery(n=5)

2.11 不同辣椒樣品中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的測定

按照前面所述樣品溶液的制備方法以及HPLC測定方法對15種辣椒中辣椒堿，二氫辣椒堿含量進行測定。結果見表7、表8。

從表7可以看出，對于不同種新鮮辣椒，其辣椒堿和二氫辣椒堿的含量與辣椒所屬種類一致，依次為云南本地小米辣＞指天椒(外引種)＞圓錐型，圓錐形辣椒中辣椒堿、二氫辣椒堿含量遠低于其它類型的辣椒。

從表8可以看出，對于干辣椒樣品，云南涮辣的辣椒堿和二氫辣椒堿的含量遠高于其他辣椒品種，各種類型辣椒辣椒堿、二氫辣椒堿含量也與辣椒所屬種類一致，云南涮辣遠高于其它類型，羊角辣椒含量最低。

從表7、表8可見，中紅河縣猛龍鄉(xiāng)哈龍村、紅河縣猛龍鄉(xiāng)(河壩地區(qū))和小米辣(江那鎮(zhèn)羊街)不同顏色辣椒的辣椒、二氫辣椒堿含量差別較大，說明不同成熟期對于辣椒堿和二氫辣椒堿含量影響較大，可以通過采摘期不同來獲得辣椒堿類物質含量較高的辣椒。

3 結論與討論

3.1 本實驗確定了辣椒堿和二氫辣椒堿高效液相色譜分析條件，并對色譜分析參數(shù)進行優(yōu)化。采用色譜柱 Hanbon Sci.＆ Tech.Lichrospher C18(250×4.6mm，5μm)分離，甲醇－3‰磷酸水溶液梯度洗脫(65%～90%，0～30min)，檢測波長 280nm，辣椒堿和二氫辣椒堿的相對標準偏差都小于1%，平均回收率都在99%以上，表明該方法準確、簡便、靈敏，可作為辣椒堿和二氫辣椒堿含量的定量分析方法。

3.2 通過對于提取工藝的考察研究，得出了辣椒堿和二氫辣椒堿的適宜提取工藝條件:提取溶劑75%乙醇溶液;超聲溫度55℃;超聲時間50min;液固比:30∶1;提取3 次。

3.3 通過對云南省不同地區(qū)不同品種辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量的研究，結果表明干辣椒中云南涮涮辣中辣椒堿和二氫辣椒堿的含量遠遠高于其它類型;鮮辣椒中圓錐形辣椒中辣椒堿和二氫辣椒堿含量遠低于其它類型辣椒;不同成熟期對于辣椒堿和二氫辣椒堿含量影響較大，可以通過采摘期不同來獲得辣椒堿類物質含量較高的辣椒。

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