凝膠凈化液相色譜法同時檢測高油脂食品中黃色2G、奶油黃和柑橘紅2色素

奚星林，王 嵐，余書奇，徐 娟，邵仕萍，潘丙珍，鄒志飛

(1.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623;2.暨南大學(xué)，廣東廣州 510623)

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強、色調(diào)多、成本低的特點，故為生產(chǎn)廠家廣泛使用。合成色素是以苯、甲苯、奈等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過一系列有機反應(yīng)而制成，合成色素因混有中間產(chǎn)物而具有一定毒性。毒理學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展證明，某些合成色素有慢性毒性或致癌性。2004年廣東和香港等地水果市場相繼發(fā)現(xiàn)“染色橙”，含禁用及可能致癌的柑桔紅2號色素。過去用于人造奶油著色的奶油黃，早已被證實可以導(dǎo)致人和動物患上肝癌，而其它種類的合成色素如橙黃能導(dǎo)致皮下肉瘤、肝癌、腸癌和惡性淋巴癌等。各國對人工合成色素在食品中允許使用的品種、范圍和添加量作了嚴(yán)格的規(guī)定，我國GB/T 2760－2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定食品中添加食用色素的范圍和用量，在我國黃色2G、奶油黃和柑橘紅2是不允許使用的。色素的測定常用液相色譜法［1－8］，黃色 2G、奶油黃和柑橘紅 2都是油溶性色素(結(jié)構(gòu)式見圖1)，檢測柑橘紅2有高效液相色譜法［9］，但目前未查到食品中黃色2G、奶油黃的檢測方法，也沒有和柑橘紅2同時檢測的文獻(xiàn)報道。本文首次報道用環(huán)己烷－乙酸乙酯提取高油脂樣品中的色素，用凝膠凈化柱凈化，反相高效液相色譜檢測食品中黃色2G、奶油黃和柑橘紅2，并用質(zhì)譜定性。

圖1 黃色2G、柑橘紅2號和奶油黃的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of yellow 2G，butter yellow and citrus red 2

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃色2G(純度98%)、奶油黃(純度98%)和柑橘紅2(純度90%) 均購自Sigma公司，甲醇、環(huán)已烷、乙酸乙酯為色譜純，其他試劑均為分析純。

高效液相色譜儀(waters 2695型，配備二極管陣列檢測器)、凝膠滲透色譜儀(美國J2 Scientific GPC)美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取 辣椒油、香腸等樣品粉碎混勻后，稱取樣品2.000g于50mL離心管中，加入環(huán)已烷－乙酸乙酯提取液10mL，于旋渦混合器渦旋1min后，超聲萃取 15min，再置于離心機中 4000r/min離心10min，吸取上清液，殘渣再加提取液10mL提取，超聲、離心，合并兩次提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至10mL，待凈化。辣椒油等油狀樣品稱取樣品1.00g，加10mL提取液溶解，待凈化。

1.2.2 樣品凈化 將凝膠柱床液面放至膠床表面后，用環(huán)已烷－乙酸乙酯把1.2.1中的提取液轉(zhuǎn)移到凝膠柱上層，待液面降至柱床表面后，再加入淋洗液洗脫。棄去前洗脫液50mL，再收集洗脫液25mL，將所得洗脫液于氮吹儀上吹干，殘渣用甲醇1.0mL溶解，經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾后待測。

1.2.3 儀器及條件 色譜柱:Ultimate C18柱(5μm，4.6mm ×250mm);流速:1.0mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:350、410、514nm;進(jìn)樣量:10μL。流動相:甲醇(A)+水，甲醇初始比例為80%。20分鐘升至100%，2min后恢復(fù)到80%。

凝膠色譜凈化條件:凝膠凈化柱:Bio－Beads，S－X3，300mm ×25(內(nèi)徑)mm;38～75μm。流動相:環(huán)己烷－乙酸乙酯(1+1，體積比，以下同)。流速:4.7mL/min。進(jìn)樣量:5mL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和曲線繪制 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取黃色2G、奶油黃和柑橘紅2標(biāo)準(zhǔn)品(10±0.1)mg，置于100mL容量瓶中，用少量甲醇液溶解，并用甲醇定容至刻度，混勻，該溶液濃度為100μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋配制 0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L 系列工作溶液。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC測定，作峰面積對濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

1.2.5 樣品分析 在相同的色譜條件下，分別將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定。以待測物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，與其對應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時以二極管陣列檢測器的光譜圖進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 凝膠層析柱洗脫規(guī)律的探索

凝膠滲透凈化是利用空間排阻(分子尺寸大小)進(jìn)行分離，能夠有效去除油脂、天然色素等高分子量的干擾物。取10mL 1μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液過凝膠滲透色譜，分為四段收集，每段六分鐘，分別收集第2(回收率1)、第3(回收率2)和第4(回收率3)段的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇定容為1mL，上液相，結(jié)果如表1。

表1 凝膠滲透凈化后3種色素標(biāo)準(zhǔn)溶液回收率(%)Table1 The recovery of 3 color standard solutions after GPC purification(%)

逐步調(diào)整分段時間，發(fā)現(xiàn)當(dāng)每段時間分別為11、10、3min，收集第2段溶液時回收率最理想，黃色2G、奶油黃和柑橘紅2號的回收率分別達(dá)到98.0%、99.5%、99.0%。

注意，定容應(yīng)用甲醇，3種待測色素在己腈中會有析出，影響檢測結(jié)果。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 黃色2G、奶油黃和柑橘紅2色譜峰的吸收波長分別為350、410，和514nm。選擇410nm為奶油黃檢測波長，350nm為黃色2G檢測波長。514nm為柑橘紅2檢測波長。

2.2.2 流動相的選擇 固定檢測波長，分別考察甲醇－水、乙腈－水、甲醇－乙酸銨溶液、乙腈－乙酸銨溶液等流動相系統(tǒng)對于待測物的色譜峰形的影響。

結(jié)果表明，以水和0.02mol/L乙酸銨溶液流動相，兩者沒有明顯區(qū)別，以甲醇－水更為簡便。隨著甲醇比例的增加，洗脫能力逐漸增強，兼顧到合適的保留時間和良好的色譜峰形，最終選擇甲醇初始比例為 80%。20min升至 100%，2min后恢復(fù)到80%。

2.2.3 柱溫的選擇 在檢測波長和流動相固定以后，對不同的柱溫(25～40℃)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30℃時，待測物的保留時間和色譜峰形最為理想。

2.3 工作曲線及方法的定量限

根據(jù)本方法所確定的實驗條件，取0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L系列工作溶液注入色譜儀中。以待測物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)對相應(yīng)色素濃度(X軸)作圖，結(jié)果表明，待測物濃度在1.0～10.0mg/L范圍內(nèi)，待測物的線性方程和線性相關(guān)系數(shù)見表2。濃度與其對應(yīng)的峰面積值呈良好線性關(guān)系。當(dāng)樣品中的待測物超過此線性范圍時，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。按信噪比為3計算方法的檢出限(以樣品計)，按信噪比為10計算方法的定量限(以樣品計)。

表2 線性方程和線性相關(guān)系數(shù)Table2 Linear equation and correlation coefficient

圖2 黃色2G、奶油黃和柑橘紅2標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(5mg/L)Fig.2 HPLC chromatograms of mixed color standard solutions(5mg/L)

2.4 方法的抗干擾能力

在空白(即未檢測待測色素)辣椒油樣品中加入黃色2G、奶油黃、柑橘紅2、蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ和蘇丹紅Ⅳ甲醇溶液，使之濃度為10.0mg/L。按1.2方法處理后上機測定，分離效果見圖2，結(jié)果表明，黃色2G、奶油黃和柑橘紅2的回收率分別達(dá)到87.6%、98.5%、82.9%，蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ在此條件下雖被提取，在色譜圖上也出峰，但其保留時間與黃色2G、奶油黃和柑橘紅2完全分離，不影響黃色2G、奶油黃和柑橘紅2的測定。

圖2 空白樣品中加標(biāo)的待測3種色素與蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ色素分離色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed colors and sudan redⅠ～Ⅳ in blank sample

2.5 試樣回收實驗

選用基質(zhì)復(fù)雜的香腸和辣椒油樣品做回收率實驗，設(shè)置3個添加濃度，每個添加濃度進(jìn)行6次實驗?；厥章式Y(jié)果見表3、表4。

表3 香腸中黃色2G、奶油黃和柑橘紅2回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)Table3 Recoveries of the mixed colors fortified to sausage(n=6)

表4 辣椒油中黃色2G、奶油黃和柑橘紅2回收率和精密度實驗結(jié)果(n=6)Table4 Recoveries of the mixed colors fortified to chili oil(n=6)

2.6 樣品檢測

對市售12個火腿腸、香腸、辣椒油、臘肉樣品進(jìn)行檢測，未檢出黃色2G、奶油黃、柑橘紅2和蘇丹紅Ⅰ～Ⅳ色素。

3 結(jié)論

本文首次利用凝膠色譜法凈化液相色譜法檢測高油脂食品中黃色2G、奶油黃和柑橘紅2色素。凝膠色譜法在去除油脂和天然色素方面效果良好，該方法具有簡便、抗干擾、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點，可以滿足實際檢測工作的需要。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760－2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.35－2003食品中人工合成著色劑的測定方法［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

［3］Fuh M R，Chia K J.Determination of sulphonated azo dyes in food by ion－pair liquid chromatography with photodiode array and electrospray mass spectrometry detection［J］.Talanta，2002，56:663－671.

［4］Minioti K S，Sakellariou C F，Thomaidis N S.Determination of 13 synthetic food colorants in water－soluble foods by reversedphase high－performance liquid chromatography coupled with diode－ array detector［J］.Analytica Chimica Acta，2007，583:103－110.

［5］Yoshioka N，Ichihashi K.Determination of 40 synthetic food colors in drinks and candies by high－performance liquid chromatography using a short column with photodiode array detection［J］.Talanta，2008，74:1408－1413.

［6］Ma M，Luo X B，Chen B，et al.Simultaneous determination of water－soluble and fat－ soluble synthetic colorants in foodstuff by high－performance liquid chromatography－diode array detectionelectrospray mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A，2006，1103:170－176.

［7］Chen Q C，Mou S F，Hou X P，et al.Determination of eight synthetic food colorants in drinks by high－performance ion chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1998，827:73－81.

［8］Oka H，Ikai Y，Kawamura N，et al.Simple method for the analysis of food dyes on reversed－phase thin－layer plates［J］.Chromatogr，1987，411:437－440.

［9］Huang H Y，Shih Y C，Chen Y C.Determining eight colorants in milk beverages by capillary electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，2002，959:317－325.

［10］Prado M A，Vilas Boas L F，Bronze M R，et al.Validation of methodology for simultaneous determination of synthetic dyes in alcoholic beverages by capillary electrophoresis［J］.Journal of Chromatography A，2006，1136:231－236.

［11］Combeau S，ChatelutM，VittoriO.Identification and simultaneous determination of Azorubin，Allura red and Ponceau 4R by differential pulse polarography:application to soft drinks［J］.Talanta，2002，56:115－122.

［12］Mercado M A，Morales－Linares JC，Granados－Garcia J，et al.Simultaneousadsorptive voltammetric analysisofmixed colorants by multivariate calibation approach［J］.Analytica Chimica Acta，1996，329:65－72.

［13］徐業(yè)平，鄭屏，湯峻松.食品中偶氮染料麗春紅2R的鑒定［J］.理化檢驗－化學(xué)分冊，2002，38(9):457－461.

［14］鄭玲，李麗華，李湧，等.凝膠滲透－高效液相色譜法測定棕櫚油中的對位紅和蘇丹色素［J］.中國油脂，2009，34(7):74－76.

［15］陳毓芳，林海丹，李為鵬，等.高效液相色譜法測定果汁和果蔬中柑橘紅2號染料［J］.理化檢驗－化學(xué)分冊，2011，47(5):536－538.