咸魚中戊糖片球菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的條件優(yōu)化

吳燕燕，王雅楠，2，李來好，楊賢慶，戚 勃，黃 卉，馬海霞

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306）

咸魚是傳統(tǒng)腌制品的代表，具有悠久的加工和食用歷史。大部分腌制品含有的亞硝酸鹽主要是在加工過程中添加，用以呈現(xiàn)良好色澤，防腐和增強(qiáng)風(fēng)味[1-3]。咸魚中的亞硝酸鹽是在腌制加工過程產(chǎn)生的亞硝酸鹽，能進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成亞硝胺化合物[4]。亞硝胺化合物具有強(qiáng)烈的致癌性，可腐蝕食管誘發(fā)食管癌[5]、肝癌、胃癌等多種癌癥[6-7]。亞硝酸鹽還原酶（Nitrite Reductase，NiRs）是一種胞內(nèi)酶，可還原亞硝酸鹽生成氨，一般存在于細(xì)菌細(xì)胞中[8]。目前學(xué)者們已經(jīng)在分子結(jié)構(gòu)上對(duì)這種酶進(jìn)行了研究，國外學(xué)者根據(jù)酶輔基結(jié)構(gòu)的不同找到了兩種NiRs，血紅素cd1型NiRs和Cu型NiRs[9-10]，并且對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)進(jìn)行了序列分析和基因克隆[11-13]。國內(nèi)學(xué)者在肉制品中已提取出NiRs，并對(duì)其發(fā)酵性質(zhì)進(jìn)行了研究[14]。在巨大芽孢桿菌中也發(fā)現(xiàn)了這種酶，研究了測(cè)定酶活的條件[15-16]。劉法佳等[17-18]從咸魚中通過篩選分離，優(yōu)選出具有降解亞硝酸鹽作用的戊糖片球菌。本文在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)戊糖片球菌含有亞硝酸鹽還原酶，對(duì)其產(chǎn)酶條件即接種量、pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，獲得戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的最適條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為進(jìn)一步提取NiRs和進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，以及此種酶在腌制食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

戊 糖 片 球 菌（Pediococcus pentosaceus，P.pentosaceus） 本實(shí)驗(yàn)室從咸魚魚肉中分離得到并經(jīng)過生理生化鑒定和GenBank的16S rDNA測(cè)序?qū)Ρ辱b定[17-18]；溶菌酶、MRS肉湯培養(yǎng)基 廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；亞鐵氰化鉀、亞硝酸鈉、硼砂 均為分析純，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；葡萄糖、乙酸鋅、氯化鈉、七水合硫酸鎂、二水合氯化鈣、一水合硫酸錳 均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠；牛肉浸膏、細(xì)菌學(xué)蛋白胨 購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸 均為分析純，購自上海晶純?cè)噭┯邢薰荆话l(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖15g/L，牛肉膏1.5g/L，細(xì)菌蛋白胨1.5g/L，K2HPO41.35g/L，KH2PO40.7g/L，NaCl 1.0g/L，NaNO20.138g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.02g/L，pH為6.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝酸鹽的測(cè)定[19]根據(jù)國標(biāo)GB 5009.33-2010中亞硝酸鹽的測(cè)定方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取50m L容量瓶若干，分別放入0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50m L已配制好的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液，其質(zhì)量相當(dāng)于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5μg亞硝酸鈉。按照國標(biāo)中的方法處理后，用普通玻璃比色皿測(cè)定吸光值。繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.2.2 亞硝酸鹽還原酶活性的測(cè)定 將菌體發(fā)酵液從培養(yǎng)箱中取出，在5000r/min離心15min去除發(fā)酵液，將沉淀物用緩沖液洗滌懸浮，按照每0.1g/100m L菌懸液添加溶菌酶。置于35℃搖床培養(yǎng)箱160r/min破除細(xì)胞壁2h，加入磷酸鹽緩沖液，超聲波35kHz提取30min，每5min振蕩一次。加入亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液混勻，使其初始濃度為1μg/m L，放入培養(yǎng)箱中1h。取100m L錐形瓶，準(zhǔn)確吸取5.0m L樣品放入瓶中，沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，處理方法見國標(biāo)[19]。取10m L上清液于離心管中，放入4℃冷凍離心機(jī)中10000r/m in離心5m in，每管吸取2.00m L上清液，置于50m L容量瓶中，加水40m L左右搖勻，每瓶中滴加2m L對(duì)氨基苯磺酸溶液混勻，避光靜置3m in，再加入1m L鹽酸萘乙二胺溶液，混勻定容，避光靜置15m in，用普通玻璃比色皿，在波長(zhǎng)538nm處測(cè)定吸光值。每組做三個(gè)平行，以等量的蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照。所得數(shù)據(jù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出亞硝酸鈉的含量[4，19]。

酶活性單位的定義：每一分鐘降解還原1μg亞硝酸鹽所需要的亞硝酸鹽還原酶量，定義為一個(gè)活力單位[20]。

1.2.3 接種量的優(yōu)化 從斜面培養(yǎng)基挑取保藏的菌種，接入液體種子培養(yǎng)基，35℃下活化兩代。將新鮮培養(yǎng)的種子液以2%、3%、4%、5%、6%接種量分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。條件控制為35℃，pH6，培養(yǎng)時(shí)間48h。每組三個(gè)平行，蒸餾水為空白對(duì)照。取1m L用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.4 pH優(yōu)化 菌種自斜面培養(yǎng)基接種入液體種子培養(yǎng)基活化兩代。將新鮮培養(yǎng)的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，用無菌1mol/L的鹽酸和1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH，分別為5.5、6、6.5、7、7.5。其他條件控制為接種量5%，35℃，培養(yǎng)時(shí)間48h[21]。培養(yǎng)過程中每隔2h調(diào)整發(fā)酵液的pH為初始值。每組三個(gè)平行，蒸餾水為空白對(duì)照。取1m L用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.5 溫度優(yōu)化 將活化兩代的新鮮培養(yǎng)的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)發(fā)酵液培養(yǎng)溫度分別為27、30、32、35、37、40℃。其他條件控制為接種量5%，pH 6，培養(yǎng)時(shí)間48h。每組三個(gè)平行，蒸餾水為空白對(duì)照。取1m L用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.6 時(shí)間優(yōu)化 菌種活化兩代后，將新鮮種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵液培養(yǎng)時(shí)間分別為24、36、48、60、72h。其他條件控制為接種量5%，pH 6，培養(yǎng)溫度35℃。每組三個(gè)平行，蒸餾水為空白對(duì)照。取1m L用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.2.7 產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的四個(gè)產(chǎn)酶條件接種量、pH、培養(yǎng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。每組三個(gè)平行，蒸餾水為空白對(duì)照。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用Excel表格統(tǒng)計(jì)并處理數(shù)據(jù)，SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)相關(guān)性和方差進(jìn)行分析，再用Origin 7.5軟件繪制曲線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)測(cè)量數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度（μg/m L）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，曲線方程為y=0.823x+0.004，R2=0.999。

圖1 亞硝酸鹽質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of nitrite concentration

2.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響

設(shè)置不同梯度的接種量培養(yǎng)戊糖片球菌，結(jié)果如圖2所示。戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的酶活性呈現(xiàn)正態(tài)分布，接種量較小時(shí)，戊糖片球菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間較長(zhǎng)，則活菌數(shù)較少，菌種產(chǎn)酶量較小。隨著接種量的增大，活菌數(shù)不斷增加，酶活性也逐漸增加，當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌種產(chǎn)酶的酶活性達(dá)到最大值，此時(shí)的酶活性為72.272U/m L，當(dāng)接種量較大時(shí)，菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期縮短，培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足，造成菌種數(shù)量減少，產(chǎn)酶量減少，酶活性有了下降的趨勢(shì)。所以接種量對(duì)于戊糖片球菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶具有一定的影響，并且最適合的接種量為5%左右。

圖2 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.2 Effectof disparate inoculate quantity on enzyme activity

2.3 pH對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響

戊糖片球菌降解亞硝酸鹽的過程分為兩個(gè)階段，弱酸環(huán)境下主要靠產(chǎn)酶降解亞硝酸鹽，強(qiáng)酸環(huán)境下主要靠產(chǎn)酸降解亞硝酸鹽。而戊糖片球菌在中性環(huán)境下活菌數(shù)最高[22]。因此產(chǎn)酶的pH梯度設(shè)置為弱酸性到中性的5.5～7.5。結(jié)果如圖3所示。隨著pH的變化，戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的酶活變化呈正態(tài)分布。數(shù)據(jù)顯示，在弱酸環(huán)境下，隨著pH的增大，活菌數(shù)量增加，酶活性有著上漲趨勢(shì)，在pH為6的時(shí)候，NiRs的酶活達(dá)到最大值73.677U/m L。當(dāng)pH＞6時(shí)，活菌數(shù)開始緩慢降低，并且酶活性有明顯的降低，說明pH的增加抑制了菌種的產(chǎn)酶量。因此發(fā)酵培養(yǎng)基的pH對(duì)于戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的酶活有一定影響，最適的產(chǎn)酶pH為6左右。

圖3 不同pH對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.3 Effect of disparate pH on enzyme activity

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響

溫度對(duì)于菌種生長(zhǎng)和酶活性的影響較大，根據(jù)乳酸菌的溫度生長(zhǎng)條件，設(shè)置因素梯度為27～40℃。將接種的發(fā)酵培養(yǎng)基放入不同溫度的培養(yǎng)箱中，NiRs酶活測(cè)定結(jié)果如圖4所示。戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的酶活呈正態(tài)分布變化，開始時(shí)隨著溫度增加，戊糖片球菌活菌數(shù)增加，酶活性逐漸增大，到30℃時(shí)達(dá)到最大值79.526U/m L，超過30℃后，酶活性受到抑制，并且呈下降趨勢(shì)，這是由于溫度的升高導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，活菌數(shù)降低，NiRs活性受到抑制。這說明菌種的培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的酶活性影響明顯。因此，戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的最適培養(yǎng)溫度應(yīng)該為30℃左右。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.4 Effectof different culture temperatures on enzyme activity

2.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果的影響

發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間如圖5所示。隨著時(shí)間的增加，戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的酶活呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期有足夠的時(shí)間積累NiRs。超過48h之后酶活性的變化趨于平穩(wěn)，在60h時(shí)測(cè)得酶活最大值為78.129U/m L。由于乳酸菌降解亞硝酸鹽的過程分為兩個(gè)階段，第一階段是酶降解，第二階段是酸降解，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基的pH會(huì)逐漸減小。雖然在60h測(cè)得最大值，但超過48h后酶活性變化不大，所以后期可能由于酸降解了亞硝酸鹽而引起測(cè)量誤差增大。由圖5可知，最適合的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)該在60h左右。

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響Fig.5 Effect of different culture time on enzyme activity

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。方差分析見表2。

由表1和表2可知，四個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶的影響大小排序是A＞D＞B＞C，接種量的F值最高，在0.01顯著水平下極顯著。這說明接種量對(duì)戊糖片球菌產(chǎn)NiRs酶活力的影響最大，是主要影響因素。pH和培養(yǎng)時(shí)間的F值小于接種量的F值，但在0.01顯著水平下也是極顯著。說明pH和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響次之，但也有較大的影響。培養(yǎng)溫度的F值小于0.05顯著水平F0.05（2，9），無顯著性差異，因此培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶酶活的影響最小。對(duì)比表1中四個(gè)因素的k值，可以得出，戊糖片球菌產(chǎn)NiRs的最佳條件為A1B2C3D1，即接種量4%，pH為6，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)獲得的最佳條件，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在此條件下培養(yǎng)戊糖片球菌，得到的NiRs酶活性達(dá)到88.153U/m L，比優(yōu)化前測(cè)量的酶活性增加了66%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Design and results of orthogonal test

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table2 Variance analysis of orthogonal test

3 結(jié)論

該研究表明，從咸魚中分離到的戊糖片球菌含有亞硝酸鹽還原酶，該酶能降解亞硝酸鹽，從而防止咸魚產(chǎn)品產(chǎn)生亞硝基化合物，對(duì)控制咸魚等腌制魚類的亞硝酸鹽和亞硝基化合物產(chǎn)生具有非常重要的作用。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)分離到的戊糖片球菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果接種量是主要影響因素，其最佳的產(chǎn)酶條件是：接種量4%，pH為6，培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h。優(yōu)化后酶活性提高了66%。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)酶最適條件，為下一步高效提取亞硝酸鹽還原酶應(yīng)用于魚類腌制加工中，以期用生物法改進(jìn)魚類腌制技術(shù)，生產(chǎn)安全的魚類腌制品奠定基礎(chǔ)[23]。

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