響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝

盧曉霆，王田田，*，王 軍

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.通化葡萄酒股份有限公司，吉林通化134002）

葡多酚抗氧化清除自由基能力強(qiáng)，在醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。不同品種的葡萄皮、籽中多酚物質(zhì)的含量及其對(duì)ABTS和DPPH自由基的影響不同，多酚含量較高的葡萄皮為刺葡萄和桑葉葡萄，含量分別為47.1mg/g和31.2mg/g，多酚含量最高的葡萄籽為赤霞珠，多酚含量為103.6mg/g[3]。發(fā)酵后的皮籽中仍含有2%左右的多酚物質(zhì)。葡萄皮籽大部分作為肥料、飼料或燒材，利用率很低。因此研究和解決葡萄皮籽利用問題，不僅有利于防止環(huán)境污染，而且可生產(chǎn)出高附加值的保健食品，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

總多酚的測(cè)定常用的方法有高錳酸鉀滴定法、香草醛法、Folin-酚法（包括Folin-Denis法和Folin-Ciocalteau法）和鐵氰化鉀分光光度法（PB法）。紫外分光光度法因其干擾性物質(zhì)較多，適用于原花青素含量純度特別高的產(chǎn)品，不適合一般原料中原花青素的檢測(cè)。香草醛法測(cè)定的是原花青素單體及其多聚體的總量。葡萄籽中總多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocalteau（FC）法和酒石酸鐵比色法，測(cè)定結(jié)果有所不同[4]，本文比較了兩種總多酚的測(cè)定方法對(duì)葡萄籽多酚提取量測(cè)定的影響，選用了其中一種用來測(cè)定多酚含量。

葡萄皮所含多酚物質(zhì)與葡萄籽有所不同，葡萄皮中有水溶性色素花色苷，而籽中沒有，對(duì)不同物質(zhì)提取方法應(yīng)有所不同[5-6]。通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助浸提葡萄籽多酚，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽多酚提取工藝[7-10]，考察工藝參數(shù)對(duì)多酚提取量的影響，確定最佳工藝參數(shù)，為葡多酚功能活性深入研究創(chuàng)造一定條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用釀酒葡萄皮籽資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒葡萄籽 由通化葡萄酒股份有限公司提供，直接收集的釀酒后下腳料山葡萄籽，自然陰干后冷藏，含水量在9%左右，采用普通粉碎，顆粒直徑在0.5～1mm[6]；95%乙醇、沒食子酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、硫酸鋰、無水碳酸鈉 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；JYL-D051型粉碎機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；UV754型可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；GL-21LM型高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；KQ-50TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄籽多酚物質(zhì)測(cè)定方法的選擇 采用酒石酸鐵比色法[4-6]準(zhǔn)確吸取1m L試液，轉(zhuǎn)移至25m L容量瓶中，加蒸餾水4m L和酒石酸亞鐵溶液5m L，充分混合，再加pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液至刻度，用10mm比色皿，在波長(zhǎng)540nm處，以試劑空白溶液作參比，測(cè)定吸光度A[11]。

FC法測(cè)定[12]，準(zhǔn)確吸取1m L試液，轉(zhuǎn)移至100m L容量瓶中，加水60m L，F(xiàn)C顯色劑5m L，混勻，30s～8m in內(nèi)各加入20%碳酸鈉溶液15m L，混合后用水定容，在20℃下放置2h然后用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定在765nm下的吸光值A(chǔ)。

FC顯色劑：稱取鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）（50± 0.01）g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）（12.5±0.01）g，用水350m L溶于1000m L回流瓶中，加入磷酸（H3PO4≥85%）25m L及50m L濃鹽酸，充分混勻，小火加熱回流2h，再加入硫酸鋰75g，蒸餾水25m L及數(shù)滴溴水；然后開口繼續(xù)沸騰15m in，使得溴水完全揮發(fā)為止；冷卻后定容500m L，過濾，置于棕色瓶中，用時(shí)加入1倍蒸餾水。

式中：W為多酚提取量，mg/g；C為待測(cè)液中多酚的濃度，mg/m L；V為待測(cè)液體積，m L；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 酒石酸鐵比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[11]：準(zhǔn)確稱取沒食子酸0.500g，加蒸餾水溶解并定容至100m L容量瓶中，得到5000mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。在7只100m L容量瓶中分別加入沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5、10m L，加蒸餾水定容至100m L，分別配制成濃度為0、50、100、150、200、250、500mg/L的試液。各吸取1m L試液于25m L容量瓶中，步驟同上，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Folin-Ciocalteau法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[12]：稱取0.500g沒食子酸，用水溶解，定容至100m L，以此母液配制質(zhì)量濃度為0、50、100、150、250、500mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1m L于100m L容量瓶，步驟同上，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 提取方法及提取溶劑的選擇實(shí)驗(yàn) 稱取葡萄籽粉碎物4份各1g，放入試管中，編號(hào)a、b、c、d。a雙水相水?。?5%乙醇6m L，水4m L，硫酸銨1g，40℃水浴2h。b雙水相超聲：95%乙醇6m L，水4m L，硫酸銨1g，40℃，35W超聲2h。c乙醇水?。?5%乙醇10m L，40℃水浴2h。d輔助超聲：95%乙醇10m L，40℃，35W超聲2h。離心，各取上清液1m L測(cè)吸光度，平行測(cè)定三次，計(jì)算多酚提取量。

稱取葡萄籽粉碎物6份各1g，準(zhǔn)確至0.0001g，分別加入10m L蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、體積分?jǐn)?shù)80%乙醇、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇、體積分?jǐn)?shù)60%乙醇、體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中。40℃，35W超聲2h。離心，各取上清液1m L測(cè)吸光度，平行測(cè)定三次，計(jì)算多酚含量。

1.2.4 粗脂肪脫除對(duì)多酚提取量的影響 通過索氏提取法利用石油醚去除粗脂肪，然后置陰涼通風(fēng)處揮盡樣品中的石油醚，稱取脫脂后的葡萄籽粉末1g，加入95%乙醇10m L，40℃，35W超聲2h。離心，取上清液1m L測(cè)吸光度。與未脫脂葡萄籽進(jìn)行比較。

1.2.5 葡萄籽總多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 液料比對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 稱取葡萄籽粉6份各1g，分別加入6、8、10、12、14、16m L體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液，在超聲功率為25W，浸提溫度40℃條件下超聲40min，測(cè)定吸光值，計(jì)算多酚提取量。

1.2.5.2 超聲時(shí)間對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 稱取葡萄籽粉6份各1g，分別加入12m L體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液，浸提溫度40℃，超聲功率25W條件下超聲20、40、60、80、100、120m in，測(cè)定吸光值，計(jì)算多酚提取量。

1.2.5.3 超聲功率對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 稱取葡萄籽粉5份各1g，加入12m L體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，浸提溫度40℃，分別在超聲功率20、25、30、35、40W條件下超聲40m in，測(cè)定吸光值，計(jì)算多酚提取量。

1.2.5.4 浸提溫度對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 稱取葡萄籽粉5份各1g，加入12m L體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液，超聲功率25W，分別在浸提溫度35、40、45、50、55℃條件下超聲40m in，測(cè)定吸光值，計(jì)算多酚提取量。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)的自變量，以多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。響應(yīng)面分析因素和水平表見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平表Table1 The table of factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

酒石酸鐵比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.0127x，R2=0.9996。Folin-Ciocalteau法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y= 0.1175x+0.0088，R2=0.9999。

圖1 酒石酸鐵法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The stand curve of ferrous tartrate

圖2 FC法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The stand curve of FCmethod

2.2 提取方法與測(cè)定方法的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明對(duì)于同一種樣品，所選用的測(cè)定方法不同，多酚所得含量結(jié)果也有所不同，葡萄籽多酚中含量較多的是黃酮醇類化合物、兒茶酸類和酚酸類化合物。FC法測(cè)定時(shí)，F(xiàn)C試劑與樣品中易氧化的羥基作用，生成藍(lán)色物質(zhì)，這樣一部分酚酸類物質(zhì)不易檢測(cè)出，而酒石酸鐵可以與大量多酚物質(zhì)反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì)，所測(cè)結(jié)果值大于FC法。對(duì)葡萄籽總多酚含量的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用酒石酸鐵法。同時(shí)可以看出，采用超聲輔助提取所得多酚量較大，這可能是因?yàn)槠咸炎讯喾訛槿鯓O性物質(zhì)易溶于乙醇溶液，超聲更有利于多酚物質(zhì)的溶出，所以采用超聲輔助提取葡萄籽多酚。

2.3 提取溶劑及粗脂肪脫除的選擇結(jié)果

從試劑安全性及成本考慮，本實(shí)驗(yàn)選取蒸餾水和乙醇兩種試劑進(jìn)行比較。由圖3可以看出，隨著乙醇濃度的減小，多酚提取量逐漸降低，葡多酚具有弱極性，易溶于極性較低的乙醇溶液。因此實(shí)驗(yàn)采用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液作為提取液來提取葡萄籽多酚。

進(jìn)行脫脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)脫脂處理的葡萄籽多酚提取量為11.55mg/g，脫脂后葡多酚提取量約為4.37mg/g，比未進(jìn)行脫脂的葡萄籽多酚提取量減少約6～7mg?？赡苁怯捎诿撝^程中部分多酚物質(zhì)溶于石油醚，隨石油醚揮發(fā)，進(jìn)而提取量下降，因此，建議提取之前不進(jìn)行脫脂處理。

圖3 提取劑對(duì)多酚提取量的影響Fig.3 Effectof extraction solvents on the yield of polyphenols

2.4 葡萄籽總多酚提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 液料比對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 由圖4可以看出，多酚提取量隨著液料比的增大而增大，但當(dāng)液料比大于12∶1后，隨著乙醇量的增大多酚含量略有增加，但幅度小?？赡苁怯捎陔S著溶劑的量增加，多酚物質(zhì)在較短時(shí)間內(nèi)與大量溶劑接觸，溶解度相應(yīng)增大，但達(dá)到一定程度后多酚幾乎溶解完全，繼續(xù)增加溶劑增幅較小，考慮成本，取液料比10∶1、12∶1、14∶1作為較優(yōu)水平。

圖4 液料比對(duì)多酚提取量的影響Fig.4 Effectof liquid-to-solid ratio on the yield of polyphenols

表2 不同浸提方式、測(cè)定方法對(duì)多酚提取量的影響Table2 Effect of extraction and measurementmethod on the yield of polyphenols

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 由圖5可以看出，多酚的提取量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，但120m in左右時(shí)略有下降?？赡苁怯捎诙喾游镔|(zhì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)慢慢浸出，但達(dá)到一定時(shí)間后浸出完全，再隨時(shí)間延長(zhǎng)多酚物質(zhì)被氧化并且雜質(zhì)溶出，所以所測(cè)提取量減小。綜合考慮，超聲時(shí)間選60、90、120m in作為較優(yōu)水平。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取量的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polyphenols

2.4.3 超聲功率對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 由圖6可以看出，葡萄籽多酚提取量隨超聲功率的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率為30W時(shí)，提取量最大。這可能是因?yàn)?，隨著超聲的增大，機(jī)械剪切力使多酚逐漸溶出，但超聲功率過大，引起多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而提取量逐漸降低[13]。選擇超聲功率30、35、40W。

圖6 超聲功率對(duì)多酚提取量的影響Fig.6 Effectof ultrasonic power on the yield of polyphenols

圖7 浸提溫度對(duì)多酚提取量的影響Fig.7 Effectofextraction temperature on the yield ofpolyphenols

2.4.4 浸提溫度對(duì)葡萄籽多酚提取量的影響 由圖7可以看出，葡萄籽多酚提取量隨浸提溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)提取量最大。可能是由于溫度升高有利于多酚物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，在不斷震動(dòng)下溶出，當(dāng)溫度上升到一定后，多酚物質(zhì)易被氧化變構(gòu)，從而影響檢出量。因此，提取溫度選擇45、50、55℃。

2.5 葡萄籽多酚提取工藝條件優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)組合，以多酚提取量為響應(yīng)值，進(jìn)行提取條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)結(jié)果見表3，對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果Table3 Box-Behnken experimental design and corresponding results

由表4分析得出，該二次回歸方程的模型項(xiàng)、單項(xiàng)D、二次項(xiàng)A2、B2、C2、交互項(xiàng)AD、BC、BD表現(xiàn)出差異極顯著，AC表現(xiàn)出差異顯著。表明該模型差異顯著。對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可得二次回歸方程如下：

回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.8981，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，可以用該方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。由表4中p值可知，在各因素所選的范圍內(nèi)，對(duì)多酚提取量影響的大小依次為D（浸提溫度）＞C（超聲功率）＞A（液料比）＞B（時(shí)間）。二次多項(xiàng)式的方差分析顯示該模型的p值小于0.01，顯著，失擬項(xiàng)p= 0.2613，不顯著。說明該模型擬合結(jié)果好[14]。綜上所述，建立的回歸方程能代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)來解釋相應(yīng)結(jié)果。

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table4 Analysis of variance of the original quadratic regressionmodel

2.5.2 葡萄籽多酚提取量的響應(yīng)面分析 由圖8可以看出，時(shí)間和超聲功率，時(shí)間和浸提溫度，液料比和浸提溫度的交互作用圖中均存在極點(diǎn)，說明交互作用顯著，與二次模型方差分析結(jié)果一致。圖8（a）顯示，在一定范圍內(nèi)，溫度和液料比一定的情況下，浸提時(shí)間在100m in左右，超聲功率為35W左右時(shí)，多酚提取量較高?？梢钥闯觯S著時(shí)間的延長(zhǎng)提取量逐漸增大，但超過100m in后，提取量迅速減小，可能是長(zhǎng)時(shí)間的超聲破壞了多酚結(jié)構(gòu)并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)部分多酚氧化，從而影響了提取量。由圖8（b）顯示，當(dāng)液料比和超聲功率一定時(shí)，多酚提取量隨溫度的升高變化緩慢，但隨時(shí)間的延長(zhǎng)提取量增長(zhǎng)較快，大約在45℃時(shí)較高。由圖8（c）可以看出，在超聲功率與時(shí)間一定的情況下，多酚提取量隨浸提溫度和液料比的不同變化顯著，浸提溫度達(dá)到45℃左右，液料比為13∶1左右時(shí)，提取量較高。由圖8（d）顯示，在浸提溫度和時(shí)間一定的情況下，提取量隨著超聲功率和液料比的增大先增大后減小。

圖8 各因素交互作用對(duì)多酚提取量的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface showing the pairwise interactive of four operating parameters on the extraction yield of polyphenols

2.5.3 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和檢驗(yàn) 結(jié)合響應(yīng)面分析方差分析結(jié)果得到最佳提取工藝參數(shù)為，液料比13.09∶1，浸提時(shí)間100.64m in，超聲功率36.49W，浸提溫度45.03℃。在此條件下，葡萄籽多酚的提取量為17.47mg/g，提取率約達(dá)87.4%（釀酒后的葡萄籽中多酚含量大約占2%左右，1g葡萄籽中則大約含20mg多酚）。為方便實(shí)際操作，將工藝參數(shù)修訂為液料比13∶1，浸提時(shí)間100min，超聲功率36W，浸提溫度45℃。實(shí)際測(cè)得多酚提取量為17.22mg/g，與預(yù)測(cè)值基本吻合。此條件下，進(jìn)行第二次浸提，得多酚2.03mg/g，提取量較少，考慮試劑成本，可以忽略，只浸提一次。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)葡萄籽總多酚的測(cè)定選用酒石酸鐵法所得多酚含量較高，對(duì)多酚的測(cè)定具有一定的實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值。采用超聲波輔助提取葡萄籽多酚，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的提取多酚的最佳工藝條件為液料比13∶1，浸提時(shí)間100min，超聲功率36W，浸提溫度45℃。實(shí)際多酚提取量為17.22mg/g，說明該工藝合理，進(jìn)行一次可以較充分提取，在實(shí)際應(yīng)用過程中具有一定的實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值。

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