褐色喜熱裂孢菌Thermobifida fusca產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

薛 蓓，王治賓，劉振東，韋宇拓

（1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000；2.成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司，四川成都610041；3.廣西大學(xué)微生物及植物遺傳工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530003）

淀粉酶是一類重要的工業(yè)用酶，目前淀粉酶的主要工業(yè)用途是用于生產(chǎn)葡萄糖和麥芽糖[1]。大多數(shù)的α-淀粉酶催化水解淀粉產(chǎn)生大量糊精和葡萄糖，但也有報(bào)道，有些α-淀粉酶水解淀粉主要產(chǎn)物是麥芽糖[2]。麥芽糖因具有甜度低、吸潮性低、防止淀粉老化等優(yōu)良性質(zhì)而廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域。產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶具有轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)速度快、耐溫性高及液化能力強(qiáng)等特點(diǎn)，從而非常適合于淀粉的轉(zhuǎn)化工業(yè)化生產(chǎn)，因而尋找高產(chǎn)麥芽糖的α-淀粉酶成為淀粉酶工業(yè)領(lǐng)域中一個(gè)研究熱點(diǎn)。

T.fusca的α-淀粉酶能夠水解淀粉產(chǎn)生一定的麥芽糖[3]，本研究以T.fusca基因組DNA為模板，克隆其產(chǎn)麥芽糖淀粉酶的基因片段（tfa），與表達(dá)載體pSE380連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM 109中得到重組菌。重組菌在IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)。然后對(duì)該酶進(jìn)行了分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)研究，以期為今后的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Thermobifida fusca編號(hào)為DSMZ 43792 購自德國(guó)菌種保藏中心；表達(dá)載體pSE380、大腸桿菌JM 109、BL21 廣西大學(xué)酶工程與發(fā)酵研究所保存；Prime starDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、λHind III DNA Marker、DnaseI 大連寶生物（TaKaRa）生物工程有限公司；小量PCR產(chǎn)物試劑盒 Omega Bio Tek公司；W 2003 DNA Marker廣西大學(xué)酶工程與發(fā)酵研究所自行構(gòu)建；其他試劑 均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

冷凍離心機(jī)日立CR22F日立工機(jī)株式會(huì)社；PCR儀Biometra UNOII Thermoblock 德國(guó)Biometra公司；核酸電泳儀Amersham Biosciences 美國(guó)安瑪西亞公司；高效液相色譜分析儀Agilent 1100 series美國(guó)安捷倫公司；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)JY92-2D 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的tfa基因（Genbank ID：CP000088.1）設(shè)計(jì)三條擴(kuò)增引物分別擴(kuò)增含信號(hào)肽和去除信號(hào)肽的T.fuscaα-淀粉酶基因。為便于基因與載體的連接，在上下游分別加入Nco I和Eco R I的酶切位點(diǎn)（帶下劃線），同時(shí)為方便后期的過鎳柱純化目的蛋白，設(shè)計(jì)引物時(shí)在表達(dá)的目的蛋白基因前端加上6個(gè)組氨酸尾巴序列，并委托鼎安生物公司合成。

其中，引物Sense1和Antisense擴(kuò)增的是含信號(hào)肽的T.fuscaα-淀粉酶基因，而引物Sense2和Antisense擴(kuò)增的是去除信號(hào)肽的T.fuscaα-淀粉酶基因。

1.2.2 tfa基因的擴(kuò)增 以T.fusca基因組DNA為模板，擴(kuò)增tfa和sptfa。反應(yīng)體系為25μL，2步PCR反應(yīng)：98℃ 10s，68℃ 2m in，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10m in。取3μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DNA測(cè)序委托上海鼎安生物公司進(jìn)行。

1.2.3 tfa表達(dá)載體的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)及純化

將純化的tfa用Nco I和Eco R I進(jìn)行雙酶切連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pSE380上，經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證得到重組表達(dá)質(zhì)粒pSE380-tfa（去除信號(hào)肽）和pSE380-sptfa（含自身信號(hào)肽），去除信號(hào)肽JM 109/ pSE380-tfa。把重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。將轉(zhuǎn)化子在37℃搖床中培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.8左右時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)到1mmol/L在37℃繼續(xù)培養(yǎng)10h。培養(yǎng)好的發(fā)酵液在4000r/m in轉(zhuǎn)速下離心7m in，用磷酸緩沖液（pH 7.0）重懸菌體，然后在冰浴條件下超聲波破胞（350W破胞，工作8s，間歇10s，30個(gè)循環(huán)），破胞后收集上清，使用金屬鎳親和層析法進(jìn)行純化，利用SDS-PAGE凝膠電泳來檢測(cè)純化效果[4]。

1.2.4 酶活的測(cè)定 淀粉酶活力測(cè)定參照Bernfeld法[5]：取450μL 5%（w/v）可溶性淀粉加入1.5m LEppendorf管中，加入50μL適當(dāng)稀釋的酶液，而空白對(duì)照管中加入50μL已失活的酶液，60℃反應(yīng)5m in后，加入500μL DNS以終止酶反應(yīng)，沸水浴5m in，迅速于流動(dòng)水中冷卻后，在520nm處測(cè)OD值。酶活力單位定義為在最適溫度及最適pH條件下，按上述反應(yīng)，每m in生成1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（1U）。

1.2.5 重組酶含量測(cè)定 按照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》中的Bradford測(cè)定方法來計(jì)算蛋白質(zhì)濃度[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 T.fuscaα-淀粉酶基因的克隆

提取T.fusca的總DNA[7]。以DNA為模板用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增含信號(hào)肽和去除信號(hào)肽的T.fuscaα-淀粉酶基因，電泳結(jié)果表明：含信號(hào)肽的PCR產(chǎn)物為1.8kbp左右，去除信號(hào)肽后為1.7kbp左右，與預(yù)期的結(jié)果相符（見圖1）。

圖1 T.fusca總DNA和PCR產(chǎn)物Fig.1 Total DNA of T.fusca，PCR products and restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid pSE380-tfa

2.2 T.fuscaα-淀粉酶在大腸桿菌中的表達(dá)

2.2.1 T.fuscaα-淀粉酶基因的SDS-PAGE電泳 按照1.2.3所述方法對(duì)菌株JM 109/pSE380-tfa進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析：在大約64ku處有明顯的特異性條帶（圖2泳道3），與預(yù)期大小相符，而對(duì)照菌株JM 109/pSE380（圖2泳道2）在64ku處沒有明顯的特異性條帶，由此可以判斷重組質(zhì)粒pSE380-tfa在大腸桿菌JM 109能夠成功地表達(dá)，利用組氨酸標(biāo)簽對(duì)上清初酶液進(jìn)行鎳柱親和層析一步法純化，SDS-PAGE分析如圖2泳道4、5所示，純化后獲得了清晰的目的條帶，純度可以用于下一步各項(xiàng)酶學(xué)特性的研究。

圖2 重組質(zhì)粒pSE380-tfa表達(dá)產(chǎn)物SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of the expression of recombinant plasmid pSE380-tfa

2.2.2 大腸桿菌中酶活性的定位 T.fuscaα-淀粉酶基因的全長(zhǎng)是1818bp（含基因前面自身信號(hào)肽），用SMART服務(wù)器分析該酶的結(jié)構(gòu)功能域，分析得出：由DNA推測(cè)的α-淀粉酶前體蛋白由605個(gè)氨基酸組成，T.fuscaα-淀粉酶基因序列前面1～33aa殘基為信號(hào)肽結(jié)構(gòu)域，34～605aa殘基為T.fuscaα-淀粉酶功能結(jié)構(gòu)域。前體α-淀粉酶的N-端信號(hào)肽序列，具有信號(hào)肽序列所擁有的典型特點(diǎn)：有一個(gè)富含疏水氨基酸的中央核心序列，靠近C-端有極性氨基酸，N-端有正電荷氨基酸，同時(shí)具有能被信號(hào)肽酶識(shí)別的A la-X-Ala盒剪切位點(diǎn)。

將含淀粉酶自身信號(hào)肽的菌株JM 109/pSE380-sptfa，去除信號(hào)肽JM 109/pSE380-tfa以及對(duì)照菌株JM 109/pSE380同時(shí)點(diǎn)到LB錐蟲藍(lán)淀粉篩選平板上，37℃過夜培養(yǎng)20h后，于自然生長(zhǎng)情況下直接觀察其產(chǎn)生的水解圈，發(fā)現(xiàn)有自身信號(hào)肽的轉(zhuǎn)化子pSE380-sptfa在篩選板上產(chǎn)生的水解圈更大更明顯，去除信號(hào)肽的轉(zhuǎn)化子pSE380-tfa菌落周圍的水解圈非常小，而對(duì)照菌即轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒pSE380的轉(zhuǎn)化子菌落周圍沒有水解圈（見圖3）。

圖3 含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽菌株的錐蟲藍(lán)染色平板培養(yǎng)比較Fig.3 Comparison between the trypan blue plate culture of strain with signal peptide and without

在相同條件下培養(yǎng)，將含淀粉酶自身信號(hào)肽的菌株JM 109/pSE380-sptfa，去除信號(hào)肽JM 109/pSE380-tfa以及對(duì)照菌株JM 109/pSE380同時(shí)進(jìn)行20℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)20h，用Vivaflow200超濾器將培養(yǎng)基上清液濃縮40倍，再于4℃將上一步得到的濃縮液用排阻極限為30000的MILLIPORE過濾器繼續(xù)超濾濃縮40倍后得到胞外酶液；將收集的菌體懸浮于0.05mol/L（pH 7.0）的磷酸鈉緩沖液中，然后進(jìn)行超聲波破胞后得到胞內(nèi)酶液，在同樣條件下測(cè)定胞外酶活與胞內(nèi)酶活，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出含有信號(hào)肽的轉(zhuǎn)化子pSE380-sptfa培養(yǎng)基上清有酶活，但在胞內(nèi)殘留的酶活也較高；而不含信號(hào)肽的轉(zhuǎn)化子pSE380-tfa培養(yǎng)基上清只檢測(cè)很低的酶活，這說明T.fuscaα-淀粉酶基因自身的信號(hào)肽具有一定的分泌能力[8]。

表1 重組大腸桿菌菌株的酶活分布Table1 Distribution of alpha-amylase activity of recombinant strain E.coli JM109

2.3 T.fuscaα-淀粉酶基因（tfa）酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 T.fuscaα-淀粉酶的底物特異性 將純化后的T.fusca淀粉酶純酶與α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精反應(yīng)，然后進(jìn)行酶活測(cè)定以及HPLC分析，結(jié)果表明該酶對(duì)α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精不起作用，說明該酶作用方式是內(nèi)切的（endolytic）[9-10]，該酶為內(nèi)切型淀粉酶。

2.3.2 酶的最適pH和pH穩(wěn)定性 將酶加入到用不同pH的磷酸鈉緩沖體系配制的1%（w/v）可溶性淀粉中，60℃時(shí)測(cè)定酶活性，獲得pH-活力曲線（見圖4），從圖中可知酶的最適反應(yīng)pH為7.0。將酶在不同的pH下處理30m in后，然后與1%（w/v）可溶性淀粉在最適條件（pH 7.0，溫度60℃）測(cè)其剩余酶活，以未處理的原酶液活力為100%，測(cè)定該酶的pH穩(wěn)定性（見圖4），結(jié)果顯示該酶在pH6.0～8.0時(shí)，相對(duì)酶活均在80%以上，說明該酶具有較好的pH穩(wěn)定性。

圖4 pH對(duì)tfa酶活的影響Fig.4 Effectof pH on the enzyme activity of tfa

2.3.3 酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性 將酶與1%（w/v）可溶性淀粉（磷酸鈉緩沖液，pH 7.0）在不同溫度下（30～80℃）測(cè)定酶活性以確定該酶的最適反應(yīng)溫度（見圖5），從圖中可知酶的最適溫度60℃。將酶液在不同溫度下（30～80℃）保溫30min后，再在最適條件（pH 7.0，溫度60℃）測(cè)其殘余酶活力，獲得溫度穩(wěn)定性曲線（見圖5）。從穩(wěn)定性曲線圖上可看出，該酶在不超過60℃時(shí)穩(wěn)定，當(dāng)溫度高于65℃酶的失活速度加快?？梢娫撁妇邆湟欢ǖ氖葻崽匦?。

圖5 溫度對(duì)tfa酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity of tfa

2.3.4 EDTA和Ca2+對(duì)本實(shí)驗(yàn)T.fuscaα-淀粉酶的影響 將不同濃度的EDTA加入到酶與底物的反應(yīng)體系中，結(jié)果表明EDTA對(duì)本實(shí)驗(yàn)T.fuscaα-淀粉酶有抑制作用（圖6）。α-淀粉酶一般需要Ca2+的活化，同時(shí)Ca2+還能使酶穩(wěn)定，但是有些細(xì)菌和根霉菌的α-淀粉酶，其穩(wěn)定性不需要Ca2+。由圖7可以發(fā)現(xiàn)外加2mmol/L Ca2+對(duì)T.fuscaα-淀粉酶的穩(wěn)定性作用不是很明顯。

圖6 EDTA對(duì)tfa酶活的影響Fig.6 Effectof EDTA on the enzyme activity of tfa

圖7 Ca2+對(duì)tfa酶活的影響Fig.7 Effectof Ca2+on the enzyme activity of tfa

2.3.5 金屬離子對(duì)酶活的影響 在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中，在最適pH 7.0、最適溫度60℃條件下，分別用配制的含有2mmol/L金屬氯化物（Na+、Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Hg2+等）的緩沖液代替反應(yīng)體系中的緩沖液。加有金屬離子的酶液在50℃中保溫30m in后，定量測(cè)出剩余酶活，求出相對(duì)酶活，結(jié)果見表2。

表2 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)tfa酶活的影響Table2 The effect ofmetal ions and chemicals on the enzyme activity of tfa

由表2可以看出，外加2mmol/L的Ba2+、Cu2+、Co2+對(duì) T.fuscaα-淀粉酶的活性有激活作用；加2mmol/L的Mn2+、Mg2+、Li+、巰基乙醇、碘醋酸鹽對(duì)T.fuscaα-淀粉酶活性影響不大；加2mmol/L的Fe3+、EDTA對(duì)T.fusca α-淀粉酶活性有一定的抑制作用，相對(duì)活力分別只有原來的84%和90%；重金屬離子Hg2+、Ag+對(duì)T.fusca α-淀粉酶活性有很強(qiáng)的抑制作用，加2mmol/L的Hg2+處理后α-淀粉酶活性只有原來的16%，而加Ag+處理后α-淀粉酶活性只有原來的50%；Zn2+對(duì)T.fuscaα-淀粉酶活性失活作用最大，加2mmol/L的Zn2+α-淀粉酶活性只有6.5%。

2.3.6 T.fuscaα-淀粉酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值及最大反應(yīng)速度Vmax的確定 以可溶性淀粉為底物，在不同底物濃度下測(cè)定酶活，根據(jù)測(cè)定結(jié)果求出該酶對(duì)底物的米氏常數(shù)Km值及對(duì)應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vmax相關(guān)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如圖8所示，得出本研究麥芽糖淀粉酶的Km值為1.305mg/m L，Vmax值為338.0U/mg蛋白質(zhì)。

圖8 tfa的動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km值Fig.8 The Km of tfa

2.3.7 T.fuscaα-淀粉酶水解特性的研究 在1m L含有1.5%（w/v）可溶性淀粉底物的磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）中加入100μL純酶，在50℃水浴10h后，產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析（見表3，標(biāo)樣圖未示）。從表3可以看出該酶能將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的混合物。

表3 麥芽糖α-淀粉酶水解可溶性淀粉產(chǎn)物的濃度比Table3 The concentration of reaction products by maltose-producingα-amylase hydrolysis soluble starch

3 討論

目前能水解淀粉得到高麥芽糖水解物的α-淀粉酶基因的報(bào)道并不是很多，AmmarYB[11]、Collins BS等[12]報(bào)道了兩種可水解淀粉產(chǎn)生超高麥芽糖漿的新型的麥芽糖α-淀粉酶，但是其反應(yīng)溫度低、淀粉濃度低及反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)給生產(chǎn)上耗能、純化及設(shè)備的占有帶來了巨大的生產(chǎn)成本壓力。本研究中菌株T.fuscaα-淀粉酶能將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖（分別占總產(chǎn)物的16.4%、33.2%和50.4%）的混合物，盡管麥芽糖產(chǎn)量不如AmmarYB和Collins BS等報(bào)道的淀粉酶，但該酶具有耐熱性高、pH穩(wěn)定范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，因此具有一定的應(yīng)用前景。在本研究中也發(fā)現(xiàn)T.fuscaα-淀粉酶對(duì)淀粉的水解，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)麥芽三糖的含量在逐漸減少，而麥芽糖、葡萄糖的含量都有所增加（數(shù)據(jù)未列出），可見需要對(duì)T.fuscaα-淀粉酶進(jìn)行進(jìn)一步的研究或者進(jìn)行分子改造。

大腸桿菌表達(dá)其他外源蛋白時(shí)可以是有活性的可溶性表達(dá)，也可能形成不能正確折疊以至于表達(dá)后沒有活性的包涵體顆粒，其中包涵體形成后存在于細(xì)胞質(zhì)中，其形成的原因有很多可能因素，如使用了不合適的表達(dá)載體，基因自身中帶較多不能被大腸桿菌很好識(shí)別的稀有密碼子以及誘導(dǎo)表達(dá)條件等，同時(shí)對(duì)包涵體復(fù)性也是相當(dāng)復(fù)雜且困難的過程；可溶性表達(dá)的蛋白位于細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)空間中，有的還可以分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基中。同時(shí)大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，與革蘭氏陽性菌不同，它具有細(xì)胞壁和外膜，這就使得要在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)外源蛋白分泌表達(dá)變得非常困難，但是也有關(guān)于在外源基因自身信號(hào)肽的引導(dǎo)下，大腸桿菌將外源蛋白分泌到胞外的報(bào)[13-14]。盡管如此，在大部分情況下，大腸桿菌很難識(shí)別外源基因自身前端的信號(hào)肽序列并應(yīng)用于其分泌基因產(chǎn)物，所以外源基因的表達(dá)產(chǎn)物一般存在于周質(zhì)空間[15-16]。

本研究以表達(dá)型質(zhì)粒pSE380為載體，將帶有完整自身信號(hào)肽的T.fuscaα-淀粉酶基因克隆到大腸桿菌JM 109中，得到了一株能分泌表達(dá)產(chǎn)物的菌株JM 109/pSE380-sptfa，通過測(cè)定胞外和胞內(nèi)淀粉酶活性發(fā)現(xiàn)：淀粉酶有相當(dāng)一部分（約30%左右）被分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)基上清中，并且表達(dá)出活性，用Vivaflow200超濾器將培養(yǎng)基上清液濃縮40倍，再于4℃將上一步得到的濃縮液用排阻極限為30000的M ILLIPORE過濾器繼續(xù)超濾濃縮40倍后得到胞外酶液，將其胞外酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析檢測(cè)到了目的蛋白，對(duì)菌株JM 109/pSE380-sptfa進(jìn)行細(xì)胞壁裂解實(shí)驗(yàn)（即用溶菌酶處理陽性克隆菌JM 109/pSE380-sptfa及對(duì)照菌JM109/pSE380）也發(fā)現(xiàn)菌株JM 109/pSE380-sptfa的細(xì)胞變得更脆弱易于破碎，推測(cè)可能是因?yàn)榇竽c桿菌大量表達(dá)外源DNA產(chǎn)物時(shí)會(huì)損傷自身的細(xì)胞壁，導(dǎo)致了T.fusca的α-淀粉酶能分泌到培養(yǎng)基上清中[17-18]。

4 結(jié)論

本研究分別構(gòu)建了含T.fuscaα-淀粉酶基因片段（tfa）的重組質(zhì)粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa，將菌株JM 109/pSE380-tfa進(jìn)行低溫誘導(dǎo)后獲得高效表達(dá)，利用金屬鎳親和層析對(duì)菌株JM 109/pSE380-tfa表達(dá)的α-淀粉酶進(jìn)行純化，SDS-PAGE顯示純化蛋白的分子量約為64ku，Km值為1.305mg/m L，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適pH為7.0，HPLC分析表明該麥芽糖淀粉酶能將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的混合物。

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