響應(yīng)面法優(yōu)化可得然膠發(fā)酵培養(yǎng)基

袁 方，趙雙枝，蘇 理，張彥昊，郭宏明

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353；2.山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，山東濟(jì)南250013；3.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東濟(jì)南250013；4.泰興市一鳴生物制品有限公司，江蘇泰興225433）

微生物多糖是微生物在代謝過程中天然合成的聚合物[1]，具有安全、無毒等優(yōu)良的理化性質(zhì)及其他方面的特性。因此，在生物多糖領(lǐng)域中微生物多糖是近數(shù)十年來的研究熱點[2]。

可得然膠（curd lan）最初是由日本大阪大學(xué)的原田教授[3]通過一株名為A lcalingenes faecalis Var—mgxgenes 10C3的細(xì)菌發(fā)酵得到的細(xì)胞外多糖。1996年美國FDA批準(zhǔn)并允許可得然膠作為一種直接的添加劑用于食品行業(yè)[4]。我國從1999年開始把可得然膠作為食品添加劑開發(fā)的重點[5]，2006年，我國批準(zhǔn)可得然膠作為新型的食品添加劑。

提高產(chǎn)量是發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵，培養(yǎng)基配方對可得然膠產(chǎn)量影響較大，因此培養(yǎng)基優(yōu)化工作非常必要[6]。國內(nèi)對可得然膠培養(yǎng)基優(yōu)化方面的研究報道較少。李衛(wèi)旗等[7]通過對可得然膠產(chǎn)生菌株的誘變，獲得1株遺傳性狀穩(wěn)定，可得然膠產(chǎn)量為29.1g/L的菌株。詹曉北等[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中NH4Cl濃度提高到3.6g/L時，可得然膠的產(chǎn)量可達(dá)30.5g/L。近幾年來，對可得然膠的研究主要集中于應(yīng)用方面，對基礎(chǔ)發(fā)酵方面的研究報道較少。本文主要從提高多糖產(chǎn)量的角度出發(fā)，通過對可得然膠發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以期獲得更高的得率。

由于發(fā)酵培養(yǎng)基是由多成分組成，且各成分之間可能相互影響[9]，因此單靠單因素和正交實驗很難快速得到較好較嚴(yán)密的結(jié)果。本研究將PB篩選和響應(yīng)面分析聯(lián)合應(yīng)用于可得然膠發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，即采用PB設(shè)計方法考察6個實驗因素，通過統(tǒng)計學(xué)篩選出4個關(guān)鍵因素，進(jìn)一步利用Box-Behnken中心組合設(shè)計對這4個關(guān)鍵因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，再通過實驗驗證，獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。從而使可得然膠的產(chǎn)量得到較大幅度的提高，降低了生產(chǎn)成本，提高了工作效率，為可得然膠的工業(yè)化大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院保藏的一株糞產(chǎn)堿桿菌（A lcaligenes faecalis）；蔗糖 分析純，天津廣成化學(xué)試劑廠；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂 均為生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉 分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鉀、硫酸鎂、磷酸氫二銨 均為分析純，天津市巴斯夫化工有限公司；玉米漿 試劑級，山東壽光巨能金玉米公司；碳酸鈣 分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇 食品級，山東眾信集團(tuán)酒精分公司。

3924托盤天平 北京大柵欄天平廠；YXQ02手提式壓力蒸汽滅菌鍋 山東安得醫(yī)療科技有限公司；YX600W臥式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SW-59-278潔凈工作臺 廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；PHS-25 pH計 上海大普儀器有限公司；HZQ-Y振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基：蔗糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，玉米漿1.5m L/L，瓊脂15g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

種子培養(yǎng)基：蔗糖20g/L，（NH）42HPO45g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO41g/L，玉米漿1.5m L/L，CaCO33g/L，調(diào)節(jié)pH至7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖40g/L，（NH4）2HPO41.6g/L，KH2PO41.4g/L，MgSO40.7g/L，玉米漿1.7m L/L，CaCO31.4g/L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2.2 斜面菌種制備 將保存的菌種用劃線的方法接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，30℃培養(yǎng)3d。

1.2.3 種子培養(yǎng) 取一環(huán)活化好的斜面菌種，接入到裝有80m L種子培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，30℃，200r/min，搖床培養(yǎng)24h，即為種子液。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng) 按5%的接種量，將種子液接入到裝有80m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500m L三角瓶中，30℃，200r/m in，搖床培養(yǎng)5d。

1.2.5 可得然膠得率測定方法 發(fā)酵液于離心機(jī)中5000r/m in離心20m in，移出上清液，沉淀中加入2倍體積的95%乙醇，充分混合，使多糖凝聚沉淀，3000r/m in離心5m in，對沉淀用95%乙醇清洗一次，烘干后稱重。

1.2.6 可得然膠得率的計算 取100m L發(fā)酵液，根據(jù)1.2.5得率測定方法，進(jìn)行得率計算。公式如下：

式中：N—得率，g/L；W—所取發(fā)酵液中多糖干重，g；V—所取發(fā)酵液體積，L。

人口密度是商業(yè)綜合體選址的重要因素，人口密度豐富程度影響著商圈的商業(yè)發(fā)展。徐州的老城片區(qū)人口流量大，主要以傳統(tǒng)的商業(yè)為主，一些本土超市、國營傳統(tǒng)百貨、百貨大樓、古彭大廈等都選址在老城片區(qū)，是早期的商業(yè)中心。由于人口流量可以拉動消費，帶動商業(yè)綜合體的運營，商業(yè)綜合體的選址多選擇在居民點密集、高校周邊、交通便利的地方。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 P-B實驗設(shè)計 參考他人研究結(jié)果[10-11]及本實驗室前期研究結(jié)果[12-13]，選用N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計，對蔗糖、（NH4）2HPO4、KH2PO4、MgSO4、玉米漿、CaCO3進(jìn)行考察，另外取5個虛擬項進(jìn)行誤差估計，并取3組實驗中心點作為對照。每個因素取2個水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為-1，實驗中心點編碼為0，以可得然膠的得率為響應(yīng)值，各因素取值水平見表1。

表1 Plackett-Burman實驗因素與水平Table1 Levels and factors of Plackett-Burman

1.3.2 最陡爬坡實驗設(shè)計 在最陡爬坡實驗在Plackett-Burman實驗設(shè)計得到的多元一次方程的基礎(chǔ)上，根據(jù)其系數(shù)的正負(fù)及大小，來確定坡爬的方向和步長，正因素增加用量，負(fù)因素減少用量[14]。設(shè)計主要因素蔗糖、（NH4）2HPO4、MgSO4、玉米漿的最陡爬坡實驗。

1.3.3 響應(yīng)面分析實驗 根據(jù)Box-Behnken實驗的實驗原理，利用Design Expert 8.0軟件，在爬坡實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以蔗糖、MgSO4、玉米漿、（NH4）2HPO4為因子，以可得然膠得率為指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平實驗，因素水平表見表2。

表2 Box-Behnken實驗因素與水平Table2 Levels and factors of Box-Behnken

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Design Expert 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 Plackett-Burman實驗

按照N=12的Plackett-Burman設(shè)計進(jìn)行實驗，每組3個平行，響應(yīng)值為3組平行實驗得率的平均值。Plackett-Burman實驗設(shè)計及響應(yīng)值見表3，各因素效應(yīng)及顯著性分析見表4。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計與結(jié)果Table3 Plackett-Burman experimental design and results

表4 各因素效應(yīng)值及顯著性分析Table4 Various factors effect value and significance analysis

6 個因素對響應(yīng)值的影響大小依次是：A＞D＞F＞B＞C＞E，即蔗糖＞MgSO4＞玉米漿＞（NH4）2HPO4＞KH2PO4＞CaCO3，其中A（蔗糖）、B（（NH4）2HPO4）、D（MgSO4）和F（玉米漿）對可得然膠的影響顯著，因此以上4個因素是影響可得然膠得率最重要的因素，而其他成分對可得然膠產(chǎn)量影響不顯著[15]。

多元回歸方程：Y=39.92+4.68A+1.43B-0.93C-1.91D+0.74E+1.69F。模型的決定系數(shù)R2=92.12%，表明該模型擬合較好，具有較高的可信度。且整體模型的p值＜0.001，表明該多元回歸方程高度顯著[16]。

2.2 最陡爬坡實驗

響應(yīng)面擬合方程只有在鄰近區(qū)域內(nèi)才能更接近真實情況，在其他區(qū)域內(nèi)的擬合方程毫無意義。因此快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域才能有效地建立響應(yīng)面擬合方程[17]。由PB實驗分析可知，A、B和F在方程中系數(shù)為正，是顯著正因素，在最陡爬坡實驗中其用量應(yīng)增加；D在方程中系數(shù)為負(fù)，是顯著負(fù)因素，在最陡爬坡實驗中其用量應(yīng)減少。由于其他因素的影響效應(yīng)非常小，所以將其維持原始水平，對A、B、D、F進(jìn)行最陡爬坡實驗，根據(jù)效應(yīng)的大小來確定爬坡步長，以盡快逼近最大響應(yīng)區(qū)域，實驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果Table5 Design and results of the steepestascentexperiment

2.3 Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析

由表5可知，最優(yōu)條件在第3組附近，因此將其作為后續(xù)響應(yīng)面實驗的中心點。根據(jù)最陡爬坡實驗確定的Box-Behnken設(shè)計的中心點，設(shè)計4因素3水平實驗。Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果見表6，為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性，中心點重復(fù)5次。

表6 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果Table6 Box-Behnken experimental design and results

以可得然膠得率為響應(yīng)值，根據(jù)表6的實驗結(jié)果，用Design Expert 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸分析。得到的回歸方程為y=47.24+1.18A-0.56D-0.15F-0.05B+0.6AD-0.1AF-0.12AB-0.57DF-0.4DB-0.87FB-6.14A2-1.44D2-F2-1.1B2。方程的回歸系數(shù)檢驗與方差分析見表7。

表7 回歸方程方差分析表Table7 Analysis results of regression and variance

根據(jù)表7的分析可以看出，模型的相關(guān)方差R2= 96.4%，調(diào)整后的R2=96.15%，說明通過Design Expert 8.0軟件設(shè)計出的模型與實際實驗的擬合很好，該模型可以很好地預(yù)測可得然膠發(fā)酵培養(yǎng)基組分與得率之間的關(guān)系。且整體模型的p＜0.0001，表明該二次方程模型極其度顯著，可以用來對響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測，從而獲得最佳的培養(yǎng)基組成。

根據(jù)表7的檢驗結(jié)果，A（蔗糖）和D（MgSO4）對得率得影響均顯著，F(xiàn)（玉米漿）和B（（NH4）2HPO4）的影響不顯著。二次項影響顯著且系數(shù)為負(fù)，說明拋物面開口向下，有最大值。

利用Design Expert 8.0軟件，以得率最大為目標(biāo)進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化。得到的最終優(yōu)化結(jié)果為：蔗糖60.88g/L、MgSO40.97g/L、玉米漿2.48m L/L、（NH）42HPO42.41g/L，此時預(yù)測的得率最大值為47.96g/L。

為了更直觀地描述4個因素對響應(yīng)值的影響，做出模型分析圖，見圖1～圖6。響應(yīng)面分析圖是特定的響應(yīng)值y與因素A、B、D、F構(gòu)成的三維空間在二維平面上的等高圖。在每個分析圖中，對2個因素進(jìn)行分析，其余2個因素固定在零水平，可以直觀地反映出各因素的交互作用及對響應(yīng)值的影響。

圖1～圖6中幾個曲面的極值點不明顯，但可較直觀地看出各因素及其交互作用對可得然膠得率的影響，具有一定的參考價值。

圖1 （蔗糖、硫酸鎂）響應(yīng)面分析圖Fig.1 Response surface analysis chart（sucrose，MgSO4）

圖2 （硫酸鎂、玉米漿）響應(yīng)面分析圖Fig.2 Response surface analysis chart（MgSO4，corn syrup）

圖3 （蔗糖、玉米漿）響應(yīng)面分析圖Fig.3 Response surface analysis chart（sucrose，corn syrup）

圖4 （蔗糖、磷酸氫二銨）響應(yīng)面分析圖Fig.4 Response surface analysis chart（sucrose，（NH4）2HPO4）

圖1～圖3表明玉米漿對可得然膠得率影響的顯著性不明顯，而蔗糖和MgSO4對得率的影響較為顯著，過高或過低的蔗糖和MgSO4用量都會使可得然膠的得率降低，其中蔗糖的影響更為顯著，蔗糖和MgSO4的用量有最適值。圖5表明（NH4）2HPO4對可得然膠得率影響不明顯。圖6進(jìn)一步驗證了玉米漿和（NH4）2HPO4對可得然膠得率的影響均不顯著，與方差分析結(jié)果吻合。

圖5 （硫酸鎂、磷酸氫二銨）響應(yīng)面分析圖Fig.5 Response surface analysis chart（MgSO4，（NH4）2HPO4）

圖6 （玉米漿、磷酸氫二銨）響應(yīng)面分析圖Fig.6 Response surface analysischart（corn syrup，（NH4）2HPO4）

2.4 最佳培養(yǎng)基條件驗證

為了驗證實驗設(shè)計的可靠性，對上述的優(yōu)化條件進(jìn)行3次驗證實驗，并根據(jù)實際情況，將配方調(diào)整為蔗糖61g/L、MgSO41g/L、玉米漿2.5m L/L、（NH）42HPO42.4g/L，由于其他因素的影響效應(yīng)非常小，所以將其維持原始水平，即KH2PO41.4g/L、CaCO31.4g/L。可得然膠平均產(chǎn)量為47.73g/L，與預(yù)測值十分接近。說明利用響應(yīng)面法尋求最佳培養(yǎng)基的方法是完全可行的，可得然膠的得率也得到了很大的提高。

3 結(jié)論

通過對可得然膠發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究，最終確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：蔗糖61g/L、MgSO41g/L、玉米漿2.5m L/L、（NH4）2HPO42.4g/L、KH2PO41.4g/L、CaCO31.4g/L，可得然膠的得率高達(dá)47.73g/L，比優(yōu)化前提高了35.6%，比他人研究結(jié)果[8]提高了56.49%。

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