DBL法評定育肥羊精料補充料中活性Lys效價的測試條件研究

■劉晨黎 劉奕汝 高 巍 譚中平 秦洋洋

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

配合飼料中有效Lys效價的高低是評定飼料營養(yǎng)價值與品質的一項重要指標。由于在飼料加工尤其是熱處理過程中，Lys可與飼料中的許多成分發(fā)生化學反應生成強酸不穩(wěn)定性衍生物，導致采用常規(guī)分析法測定Lys回腸末端消化率時，結果不準確，而且費時費工，難以作為常規(guī)實驗項目開展，需要建立一種可準確測定活性Lys或可消化Lys含量的替代方法[1]。

染料結合法（DBL法）是測定谷物籽粒中有效Lys含量的農業(yè)行業(yè)標準方法（NY/T9—1984）[2]，但該法是否適合用于評定配合飼料中有效Lys含量尚不清楚，為此，本文對DBL法評定育肥羊精料補充料中有效Lys含量的適宜測定條件進行了初步探索，并用該法對精料補充料顆粒料中活性Lys含量進行了測定。

1 材料與方法

1.1 飼料樣品

試驗材料選用育肥羊粉料和顆粒料。樣品經粉碎過40目篩，貯存于樣品瓶中待用。

1.2 試劑的配制

試驗所用的磷酸緩沖溶液、酸性橙-12染料溶液和半飽和醋酸鈉溶液的配制按農業(yè)行業(yè)標準[2]中的方法來準備，丙酸酐為C.P級。

1.3 測定方法

1.3.1 染料標準曲線的繪制

用移液管準確吸取酸性橙-12溶液20.0 ml于200 ml容量瓶中，用磷酸緩沖液定容混勻。再用移液管分別吸取1.25、1.90、2.50、3.80、5.00 ml的稀釋后的酸性橙-12溶液于50 ml容量瓶中，用磷酸緩沖溶液定容混勻。482 nm波長測定吸光度值，繪制吸光度值(A)和酸性橙-12濃度(C)的標準曲線(見圖 1)。

圖1 酸性橙-12染料濃度的標準曲線

1.3.2 染料結合量(DBC)的計算

式中：C——相應質量樣品的總剩余染料濃度(mg/ml)；1.363——酸性橙-12 染料濃度(mg/ml)；20——酸性橙-12的溶液體積（ml）；22.2——離心管中溶液的總體積（ml）。

1.3.3 有效Lys含量的計算

式中：350.37——酸性橙-12的分子量；146.2——Lys的分子量；ΔDBC——兩離心管DBC差值。

1.3.4 樣品質量比例測定

準確稱取2份試樣，質量分別為A mg和B mg。分別置于編號為X和Y的50 ml離心管中。加入半飽和醋酸鈉溶液2.00 ml，然后在X管中加入0.20 ml丙酸酐，Y管中加入0.20 ml磷酸緩沖溶液，用玻璃棒攪拌20 min，再分別加入20.00 ml酸性橙-12染料溶液，蓋緊離心管，振蕩機上振蕩1.5 h，振蕩溫度為37 ℃，5 000×g離心15 min，取上清液1.00 ml于25 ml容量瓶中，用磷酸緩沖溶液定容，用分光光度計（722型）測定吸光度。由標準曲線查出X和Y管中剩余染料的濃度，計算DBC值和有效Lys的含量。所有測定均做平行樣。

1.3.5 ?；磻獣r間測定

準確稱取2份試樣，質量分別為1 120 mg和700 mg(質量比為1.6∶1)。分別置于編號為X和Y的50 ml離心管中。按上法加入各種試劑后，用玻璃棒分別攪拌10、20、30 min，再分別加入20.00 ml酸性橙-12染料溶液，其余操作步驟同上，測定兩管的吸光值并計算樣品中有效Lys的含量。

1.3.6 吸收平衡時間測定

除了振蕩機上振蕩時間分別為1、1.5、2 h外，其余方法步驟均同上，振蕩結束后測定2個管的吸光度值并計算樣品中有效Lys的含量。

1.3.7 育肥羊顆粒飼料有效Lys測定

按本試驗建立的最佳樣品質量比、最佳?；瘯r間、最佳吸收平衡時間等條件參數，測定顆粒料中有效Lys含量。

2 結果與討論

2.1 最佳樣品質量比

一般認為兩管中樣品質量比應為(1.2～1.6)∶1?？偟脑瓌t是控制樣品質量應使兩管反應后總的剩余染料濃度均在0.42～0.63 mg/ml，且兩管濃度之差應不超過0.1 mg/ml，否則必須調整兩管中樣品的質量再重做[3-4]。

不同樣品質量比條件下測得的有效Lys含量結果見表1。從表1可以看出，在1.6∶1組中有效Lys含量最高，其次是1.4∶1組。兩組間差異不顯著(P＜0.05)，但均顯著高于 1.2∶1組(P＜0.05)?？梢?，最佳樣品質量比應介于1.4∶1～1.6∶1之間?？紤]到1.6∶1組的有效Lys含量最高，在后續(xù)測定時均采用此比例。

表1 粉料的樣品質量比對有效Lys含量的影響

2.2 最佳酰化時間

不同?；瘯r間條件下測得的有效Lys含量見表2。當酰化時間為20 min時有效Lys含量最高，顯著高于10 min和30 min處理組（P＜0.05），因此確定最適?；磻獣r間為20 min。

2.3 最佳振蕩時間

表2 粉料樣品?；磻獣r間對有效Lys含量的影響

不同振蕩時間條件下測得的有效Lys含量結果見表3。在3組條件中振蕩時間為1 h的有效Lys含量為最高，并顯著高于其他組（P＜0.05），由此確定最適吸收平衡時間為1 h。

表3 粉料樣品振蕩時間對有效Lys含量的影響

2.4 顆粒料有效Lys含量

按本試驗建立的測定條件，用DBL法對顆粒料6個平行樣本中有效Lys含量進行了測定，結果見表4。顆粒料的有效Lys含量在0.317%～0.467%，平均含量為0.376%，變異系數CV為8.79%，測定結果比較穩(wěn)定。

表4 顆粒飼料樣品有效Lys含量測定

環(huán)模制粒是我國目前生產配合顆粒飼料的主要加工工藝。受調質條件和物料與機械等摩擦產生的熱能影響，制粒時最高溫度可達90℃[5]。室溫條件下Lys的ε-氨基與碳水化合物的醛基共存時都會引起美拉德反應，而當溫度在60℃以上時反應速度加劇[6]。配合飼料中的總Lys含量隨溫度升高而極顯著降低，所以溫度是影響配合飼料總Lys含量最重要的因素[7]。本文僅對粉料與顆粒料中有效Lys含量進行了初步的測定，今后尚需更進一步深入研究制粒工藝條件對活性Lys含量的影響規(guī)律。

表5 回收率測定結果

2.5 回收率試驗

由6個顆粒料平行樣中有效Lys測定結果，以加標量為實測平均含量的0.5倍計算出L-Lys純品的添加量，保證加標量后的總含量不超過測定上限。按上述方法進行處理測定，結果見表5?；厥章试?8.8%～108.1%之間，平均為97.05%，說明該方法的準確度較好，可用于配合飼料中有效Lys含量的測定。

3 小結

用DBL法測定有效Lys含量最適質量比為1.6∶1，?；磻獣r間為20 min，吸收平衡時間為1 h，振蕩溫度控制在37℃，平均回收率為97.05%。該方法具有操作簡單、準確度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但今后尚需進一步將此法與氨基酸自動分析儀測得結果做校對。