加速溶劑萃取-固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留

■黃福勇 何曉明 石 灝

(浙江省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心，浙江杭州 310012）

三聚氰胺(Melamine)又名蜜胺、氰尿酰胺、三聚氰酰胺，分子式為C3N6H6，是一種以尿素為原料生產(chǎn)的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，主要作為生產(chǎn)塑料樹脂的原料[1]，同時(shí)廣泛用于木材、塑料、涂料、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)[2]。研究資料表明，動物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，導(dǎo)致膀胱、腎部結(jié)石等，而氰酸和三聚氰胺反應(yīng)會產(chǎn)生可能阻礙腎臟功能的結(jié)晶[3]。三聚氰胺高溫下可能分解產(chǎn)生氰化物，動物食用后可以使動物發(fā)生腎衰竭并導(dǎo)致死亡[4]。

加速溶劑萃取是一種在較高的溫度和較大的壓力下用溶劑萃取固體或半固體的樣品前處理方法，具有有機(jī)溶劑用量少、萃取速度快、樣品回收率高等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種樣品的前處理。本試驗(yàn)采用固相萃取法進(jìn)行凈化處理，通過對不同提取試劑、不同提取方法的比較研究，優(yōu)化并確定了飼料中三聚氰胺殘留檢測的加速溶劑萃取-固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與試劑

戴安ASE 300加速溶劑萃取儀；安捷倫6890N-5973氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司SK15GT型超聲波提取儀；瑞士密理博MILLIPORE Q-GARD 1超純水儀；北京京立LG10-2.4A臺式高速離心機(jī)；美國沃特世Waters Oasis MCX固相萃取柱（60 mg/3 ml）。

試驗(yàn)試劑除特別注明均按NY/T1372—2007標(biāo)準(zhǔn)要求準(zhǔn)備，甲醇、吡啶為色譜純，其余試劑為分析純，水為制備超純水；衍生化試劑為N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺(BSTFA)和三甲基氯硅烷（TMCS），體積比99∶1。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，4℃冰箱保存，臨用時(shí)用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）配成合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 加速溶劑萃取條件

壓力：1 500 psi；溫度：100 ℃；加熱時(shí)間：5 min；靜態(tài)萃取時(shí)間：5 min；清洗體積：占萃取池體積的60%；吹掃時(shí)間：100 s；靜態(tài)循環(huán)次數(shù)：2次。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5MS，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm；載氣：氦氣；流速：1.3 ml/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣量：1 μl，不分流；升溫程序：起始溫度75℃，持續(xù)1.0 min，以30℃/min升溫至300℃，保持2.0 min。

傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：230℃；EI源轟擊能：70 eV；質(zhì)量掃描范圍：60～400 m/z；運(yùn)行時(shí)間：10.5 min；掃描模式：選擇離子掃描。監(jiān)測離子99、171、327、342 m/z，選定327 m/z為定量離子。

2 分析步驟

2.1 樣品制備

2.1.1 飼料樣品制備

飼料樣品為甲魚膨化配合飼料，經(jīng)粉碎、研磨后過篩，并干燥保存，同時(shí)進(jìn)行6次平行檢測，均未檢出三聚氰胺。

2.1.2 陽性樣品制備

選取日常檢測中檢出的陽性樣品，為某品牌烏龜配合飼料幼龜專用料，經(jīng)粉碎、研磨后過篩，并干燥保存，作為本試驗(yàn)的陽性樣品。

2.2 提取

2.2.1 加速溶劑萃取方法

稱量取樣5.0 g，取33 ml萃取池，以海砂（粒度為0.65～0.85 mm）為填料，與稱量的樣品混合均勻后轉(zhuǎn)入萃取池中，以甲醇水溶液（V∶V=1∶4）為溶劑萃取。萃取液以甲醇水溶液（V∶V=1∶4）稀釋定容到25 ml，取上層提取液8.0 ml轉(zhuǎn)入離心管，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min。

2.2.2 超聲波提取方法

稱量管中先放5.0 g海砂(粒度為0.65～0.85 mm),再稱量取樣5.0 g，準(zhǔn)確加入10%的三氯乙酸溶液25 ml。搖勻，超聲提取20 min，靜置2 min，取上層提取液8.0 ml轉(zhuǎn)入離心管，在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min。

2.3 凈化及衍生化

分別用3 ml甲醇，3 ml水活化Waters Oasis MCX柱，準(zhǔn)確移取5.0 ml離心液分次上柱,控制過柱速度在1滴/s左右，依次用3 ml水、3 ml甲醇洗滌Waters Oasis MCX柱，然后用3 ml氨水/甲醇溶液(體積比為5∶95)洗脫，收集洗脫液并用氮吹至干，加入100 μl吡啶和100 μl衍生劑，混勻，70 ℃反應(yīng)30 min，轉(zhuǎn)入微量進(jìn)樣管，立即進(jìn)行GC-MS測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性范圍

準(zhǔn)確移取適當(dāng)?shù)娜矍璋窐?biāo)準(zhǔn)溶液，分別用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）配制成5種不同質(zhì)量濃度（0.125、0.25、2.5、10.0、25.0 μg/ml）的標(biāo)準(zhǔn)工作液，取200 μl，氮吹至干，按2.3節(jié)方法衍生化后，GC/MS上樣測定。得到線性方程y=8.86×104x-2.49×104(R2=0.999）。三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品SIM質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品SIM質(zhì)譜

3.2 色譜柱選擇

分別用HP-5MS色譜柱與DB-35MS色譜柱進(jìn)樣，儀器參數(shù)及升溫程序均相同，結(jié)果表明，使用兩種柱子均可以得到低濃度三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液的譜圖，并能精確定量。因此在檢測中，可以采用HP-5MS柱和DB-35MS柱進(jìn)行陽性樣品的雙柱檢驗(yàn)。此外，使用HP-5MS柱三聚氰胺的響應(yīng)值約為DB-35MS色譜柱的1.71倍，因此，HP-5MS柱對三聚氰胺的檢測更為靈敏，檢測效率更高，本試驗(yàn)選用HP-5MS柱。

3.3 提取溶劑的選擇

NY/T 1372—2007標(biāo)準(zhǔn)中，采用10%的三氯乙酸溶液作為提取溶劑，用超聲提取法進(jìn)行提取。本試驗(yàn)中超聲提取法按NY/T 1372—2007標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，同時(shí)加入5.0 g海砂，可以有效降低飼料樣品表面強(qiáng)度，尤其能促進(jìn)提取溶劑對粉狀樣品的浸潤，從而提高提取效率。

由于三氯乙酸溶液具有較強(qiáng)腐蝕性，對加速溶劑萃取儀的萃取池和內(nèi)部管路均有一定的腐蝕作用，容易造成機(jī)器故障，本試驗(yàn)中加速溶劑萃取方法選用甲醇水溶液（V∶V=1∶4）替代10%三氯乙酸溶液作為提取溶劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用上述方法，三聚氰胺色譜圖雜峰較少，且不會對三聚氰胺目標(biāo)峰造成干擾，符合檢測分析要求。

3.4 回收率試驗(yàn)和提取效率試驗(yàn)

3.4.1 回收率試驗(yàn)

取5.00 g飼料樣品，添加3個(gè)不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.5、2.0、4.0 mg/kg）（n=6），按照上述2.2、2.3節(jié)方法進(jìn)行樣品提取和凈化，計(jì)算平均回收率和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），將10倍背景相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差作為最低定量限（LOQ），試驗(yàn)結(jié)果得出本方法對飼料中的最低檢測限為0.05 mg/kg。結(jié)果表明，使用加速溶劑萃取法，飼料樣品三聚氰胺加標(biāo)回收率為80.1%～86.3%，超聲提取法加標(biāo)回收率為78.9%～85.6%，RSD均小于10%，兩種方法的加標(biāo)回收率都能滿足檢測要求。

3.4.2 提取效率試驗(yàn)

對陽性飼料樣品分別采用加速溶劑萃取法和超聲提取法進(jìn)行處理、測定，加速溶劑萃取法測定樣品三聚氰胺含量平均值為19.50 mg/kg，RSD為4.79%(n=6)，超聲提取法測定樣品三聚氰胺含量平均值為14.84 mg/kg，RSD為9.53%(n=6)，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，表明二者存在顯著差異，加速溶劑萃取法提取效率較超聲提取法高23.90%，加速溶劑萃取法的提取效率顯著優(yōu)于超聲提取法。陽性樣品加速溶劑萃取法色譜圖見圖2。

圖2 陽性樣品加速溶劑萃取法萃取色譜

4 結(jié)論

本文建立了加速溶劑萃取-固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留，優(yōu)化了試驗(yàn)條件。使用加速溶劑萃取技術(shù)，能夠提升三聚氰胺提取效率，對陽性樣品的提取效率顯著高于超聲萃取法，本試驗(yàn)條件下高達(dá)23.90%。原因在于加速溶劑萃取方法利用升高溫度和壓力，增加物質(zhì)的溶解度和溶質(zhì)溶解效率，并可以降低飼料樣品提取液的黏度和基質(zhì)表面強(qiáng)度，克服溶劑與基質(zhì)之間的作用力，同時(shí)還可以提高溶劑沸點(diǎn)，使之保持液態(tài)，促進(jìn)溶劑進(jìn)入基質(zhì)微孔，從而顯著提高提取效率。目前，國內(nèi)質(zhì)檢機(jī)構(gòu)開展飼料中三聚氰胺檢測主要采用NY/T 1372—2007《飼料中三聚氰胺的測定》方法，該方法中樣品提取仍然是使用超聲萃取法，本文結(jié)果表明，該方法存在一定局限性，可能存在無法完全提取飼料中三聚氰胺殘留的情況。