高效脂肪酶產(chǎn)生真菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

■郭 威 郭曉軍 袁洪水 王星懿 王世英 朱寶成

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

酶制劑[1]是酶經(jīng)過提純、加工后的具有催化功能的生物制品，近年來一直是國內(nèi)外動(dòng)物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一。脂肪酶作為工業(yè)酶制劑中重要的生物催化劑之一，在飼料行業(yè)中有著廣泛的研究潛力和應(yīng)用前景。王琰等[2]建立了具有陜西特色的應(yīng)用于飼料行業(yè)的微生物脂肪酶菌種庫，K.Nar?reborg等[3]研究了豬胰脂肪酶粗提物與膽汁鹽對(duì)脂肪消化的影響，均處于起步階段。

脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[4]。目前已發(fā)現(xiàn)至少有60多個(gè)屬的微生物可以產(chǎn)生脂肪酶[5]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物脂肪酶可提高斷奶仔豬的生產(chǎn)性能，減輕斷奶仔禽、仔畜的營養(yǎng)應(yīng)激[6]，比動(dòng)物脂肪酶酶解作用的pH值和溫度范圍更寬，便于工業(yè)化生產(chǎn)獲得高純度酶制劑[7]，因此成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來源。

據(jù)報(bào)道，微生物是有效的脂肪酶產(chǎn)生者，并且霉菌能夠產(chǎn)生大量的脂肪酶[8]。本文從富含油脂的土壤中分離到1株產(chǎn)脂肪酶的真菌，經(jīng)鑒定屬于黑曲霉屬，命名為GW-1，同時(shí)對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了其最佳產(chǎn)酶條件。本試驗(yàn)將為酶制劑的生產(chǎn)提供重要的種質(zhì)資源，并為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

土樣采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)餐廳周圍富含油脂的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

真菌富集培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g、NH4NO30.1 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.1g，10 ml橄欖油。用0.1 mol/l NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0。

種子培養(yǎng)基：（NH4）2SO45.0 g、K2HPO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨25 g、橄欖油10 ml、蒸餾水1 000 ml，pH值8.0，115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO41.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、NaH2PO41.0 g、K2HPO42.0 g、橄欖油10 ml、黃豆粉 20 g、蔗糖 10 g、蒸餾水 1 000 ml，pH 值8.0，115℃滅菌30 min。

分離初篩培養(yǎng)基[9-10]：(NH4)2SO40.5 g、NH4NO30.1 g、NaCl 0.1 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、K2HPO40.5 g、FeSO4·7H2O 0.1 g、瓊脂20 g，溴甲酚紫2 mg，蒸餾水1 000 ml、pH值8.0，121 ℃滅菌15 min后，于60℃左右加含溴甲酚紫的聚乙烯醇橄欖油乳化液（12 ml/100 ml）。

橄欖油乳化液的配制：將橄欖油與2%的聚乙烯醇溶液按1∶3（v/v）混合，4℃靜置1 h后于組織攪拌機(jī)中高速勻漿3 min即得。

斜面保藏培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基[10]）：馬鈴薯200.0 g/l，蔗糖 20.0 g/l、瓊脂20.0 g/l。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選

將采集的土壤進(jìn)行富集培養(yǎng)[10]、平板分離和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩[7]，將產(chǎn)酶能力較高菌株挑選出來供進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.2 脂肪酶活力測(cè)定

采用橄欖油乳化液方法[11]測(cè)定脂肪酶活力。

酶活力單位定義：37℃、pH值7.0條件下，以每分鐘產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量定義為1個(gè)脂肪酶國際單位（U）[11-12]。

1.2.3 菌種鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定[13]

觀察真菌菌落形態(tài)、顏色、有無色素產(chǎn)生等特征，根據(jù)《常見與常用真菌》進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

以該菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行ITS基因序列分析[14]，PCR擴(kuò)增其ITS序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京福爾徹科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 產(chǎn)脂肪酶菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)確定產(chǎn)脂肪酶菌株產(chǎn)酶的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽和誘導(dǎo)物。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)

培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶的影響分別按正交試驗(yàn)表L9(34)設(shè)計(jì)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 菌種篩選

土樣經(jīng)富集、涂布平板后分離得到13株產(chǎn)脂肪酶菌株,經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩得到產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的GW-1菌株，經(jīng)測(cè)定酶活達(dá)到19.86 U/(ml·min)。該菌在溴甲酚紫篩選培養(yǎng)基上形成明顯水解圈(見圖1),故選擇GW-1作為后續(xù)試驗(yàn)研究菌株。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株GW-1在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)2～5 d。菌落迅速蔓延，初為白色，后變成鮮黃色直至褐色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色，見圖2。

結(jié)合以上GW-1菌落形態(tài)觀察，符合黑曲霉菌的相關(guān)描述，初步確定GW-1菌可能為黑曲霉菌。

2.2.2 菌株的分子學(xué)鑒定

以菌株GW-1的基因組DNA為模板，采用真菌ITS序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在700 bp處有一條特異性條帶（見圖3）。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，片段長787 bp，有典型的ITS序列特征。

圖1 菌株GW-1在溴甲酚紫培養(yǎng)基上形成明顯水解圈

圖2 菌株GW-1菌落形態(tài)

圖3 GW-1菌株的ITS序列PCR產(chǎn)物電泳

將得到的擴(kuò)增序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列同源性比對(duì)。取與GW-1菌一致性在99%以上的序列，用MEGA5.0進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建基因進(jìn)化樹(見圖4)。結(jié)果顯示，菌株GW-1與菌株CASMBSEF 15位于同一族群，親緣關(guān)系最近，表明菌株GW-1屬于曲霉菌屬的Aspergillus niger。因此，將該菌命名為Aspergillus niger GW-1。

圖4 GW-1菌株的ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 GW-1菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)

2.3.1.1 碳源對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖5）

圖5 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

將菌株在不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶活力，結(jié)果表明，碳源為麥芽糖和葡萄糖時(shí)該菌株產(chǎn)酶能力較高。由于兩者酶活相當(dāng)，故考慮到成本問題，選用葡萄糖作為最佳碳源。

2.3.1.2 氮源對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖6）

將菌株在不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶活力，結(jié)果表明，菌株在5種氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)脂肪酶活力依次為黃豆粉＞蛋白胨＞酵母膏＞尿素＞牛肉膏。因此，GW-1菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的最適氮源為黃豆粉。

圖6 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3.1.3 金屬離子對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響(見圖7)

圖7 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

將菌株在含有不同金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測(cè)定發(fā)酵液脂肪酶活力。結(jié)果表明，Mg2+對(duì)該菌株產(chǎn)酶有明顯的促進(jìn)作用，K+和Cu2+也有不同程度的促進(jìn)作用，而Fe2+、Na+、Zn2+、Mn2+和Ca2+分別有不同程度的抑制作用，其中Mn2+抑制作用最強(qiáng)，這與亓小宇報(bào)道的結(jié)果相一致[15]。

2.3.1.4 誘導(dǎo)物對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響（見圖8）

圖8 誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類的油脂作為脂肪酶的誘導(dǎo)劑，研究不同種類油脂對(duì)該菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果表明，以橄欖油作為誘導(dǎo)劑效果最佳，是未添加誘導(dǎo)油脂的7.6倍。

2.3.2 正交試驗(yàn)

2.3.2.1 培養(yǎng)基組分配比正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的優(yōu)化結(jié)果選取葡萄糖為碳源、黃豆粉為氮源、MgSO4·7H2O為無機(jī)鹽，橄欖油為誘導(dǎo)物，改變碳、氮源以及無機(jī)鹽和誘導(dǎo)物的濃度，進(jìn)行正交試驗(yàn)，搖床振蕩培養(yǎng)4 d，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 培養(yǎng)基組分配比正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析，得知各因素極差大小為R誘導(dǎo)物＞R無機(jī)鹽＞R氮源＞R碳源，即培養(yǎng)基中影響產(chǎn)酶的各因素主次順序?yàn)椋赫T導(dǎo)物、無機(jī)鹽、氮源、碳源。因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、黃豆粉2.0%、MgSO4·7H2O 0.1%、橄欖油1%。菌株GW-1在此最優(yōu)發(fā)酵條件下發(fā)酵測(cè)得的酶活為26.84 U/ml。

2.3.2.2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

以0.5%葡萄糖、2.0%黃豆粉、0.1%MgSO4·7H2O、1%橄欖油配制培養(yǎng)基，考察pH值、培養(yǎng)時(shí)間、裝液量和接種量對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響。對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過不同培養(yǎng)時(shí)間的搖床培養(yǎng)，按照不同的接種量，再將其分別接種到不同pH值和裝液量的發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)4 d后測(cè)定酶活力。結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶有著重要影響(見表2)。

表2 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)表2中數(shù)據(jù)直觀分析得知，各因素極差的大小為RB＞RA＞RC＞RD，培養(yǎng)條件中影響脂肪酶產(chǎn)生的各因素主次順序?yàn)椋築＞A＞C＞D，最佳的組合是A3B1C2D2。

由于正交試驗(yàn)處理中不包含有上述工藝條件組合,為此選取最佳A3B1C2D2組合和相近組合,即正交試驗(yàn)中脂肪酶產(chǎn)生最多的組合7在同等條件下進(jìn)行驗(yàn)證。如表3所示，最佳組合脂肪酶酶活達(dá)到了39.82 U/(ml·min)，而組合7的脂肪酶酶活為32.64 U/(ml·min)，因此培養(yǎng)條件的最佳組合為初始培養(yǎng)基pH值9.0、培養(yǎng)時(shí)間4 d、接種量8%、裝液量50 ml/250 ml，在此優(yōu)化條件下脂肪酶酶活達(dá)到39.82 U/(ml·min)。

3 討論

3.1 菌株的篩選與鑒定

產(chǎn)脂肪酶的微生物廣泛分布在細(xì)菌、真菌和放線菌中。國內(nèi)已進(jìn)行了很多有關(guān)脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選研究，已報(bào)道的菌株主要集中在假單胞菌屬[16]、根霉屬[17]和青霉屬[9]等。本試驗(yàn)分離篩選獲得的產(chǎn)酶菌株根據(jù)ITS基因序列并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為黑曲霉Aspergillus niger，而目前關(guān)于此屬菌株能夠產(chǎn)脂肪酶的研究報(bào)道很少，且黑曲霉有著發(fā)酵成本較低、較易成活等優(yōu)勢(shì)，具有較大的開發(fā)潛力和進(jìn)一步深入研究的價(jià)值。

據(jù)報(bào)道，使用三丁酸甘油酯和吐溫這樣的人工脂質(zhì)作為底物來檢測(cè)脂肪酶活性被廣泛推薦使用，但它們可能被酯酶水解而產(chǎn)生假陽性結(jié)果[18]。本文采用的橄欖油乳化法具有快速、靈敏的特點(diǎn)，由于使用天然底物故能篩選出真正產(chǎn)脂肪酶的菌株。

薛靜等[19]報(bào)道的菌株09-7-1優(yōu)化后脂肪酶活力達(dá)24.112 U/ml。趙偉等[20]報(bào)道的菌株CS1-1最大酶活達(dá)（37.6±0.8）U/ml。本研究獲得的菌株GW-1在優(yōu)化條件下，發(fā)酵液中粗酶活力可以達(dá)39.82 U/（ml·min），較上述報(bào)道的菌株脂肪酶活力高，充分顯示了該菌株在產(chǎn)脂肪酶能力上的優(yōu)越性。

3.2 碳源、氮源、金屬離子及誘導(dǎo)物對(duì)GW-1菌株產(chǎn)酶的影響

關(guān)于碳源、氮源對(duì)細(xì)菌產(chǎn)酶活性的影響，一些研究指出以葡萄糖為碳源可獲得理想的發(fā)酵效果[15]，本試驗(yàn)結(jié)果與其基本一致；另外，報(bào)道中脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)多采用牛肉膏為氮源[21]，而本試驗(yàn)所選細(xì)菌以黃豆粉為氮源時(shí)，產(chǎn)酶效果明顯好于以牛肉膏為氮源，這可能是因?yàn)槲⑸锓N類不同所致，并且也降低了生產(chǎn)成本。

與Rohit等[22]報(bào)導(dǎo)的結(jié)果相一致，本研究獲得的菌株GW-1產(chǎn)酶依賴Mg2+濃度，添加微量Mg2+時(shí)產(chǎn)酶活性最高，但濃度過大會(huì)抑制該菌株的產(chǎn)酶活性。Fe2+、Na+、Zn2+和 Mn2+有不同程度的抑制作用，這種抑制效應(yīng)可能是由于金屬離子改變了酶活性部位的構(gòu)象所引起。

大多數(shù)水解酶類是誘導(dǎo)酶，很多菌株產(chǎn)生的脂肪酶也多屬于誘導(dǎo)酶，在培養(yǎng)基中添加適量油脂、表面活性劑及其某些結(jié)構(gòu)類似物可有效促進(jìn)產(chǎn)脂肪酶菌產(chǎn)酶或提高酶活性[23]。在體積分?jǐn)?shù)為1%橄欖油的條件下產(chǎn)酶可提高7.6倍，但過多的橄欖油又會(huì)抑制脂肪酶的產(chǎn)生，這可能是因?yàn)橛椭到夂蟮闹舅釋?duì)脂肪酶有阻遏抑制的作用。

4 結(jié)論

獲得1株高產(chǎn)脂肪酶真菌，該菌株產(chǎn)脂肪酶的報(bào)道較少。

通過正交試驗(yàn)，該菌株GW-1產(chǎn)酶活力較優(yōu)化前提高了100.50%。