microRNA與腫瘤細(xì)胞周期的關(guān)系及其研究方法進(jìn)展

周玨宇，石 嶸，鄭文嶺，馬文麗

(南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所，廣東廣州510515)

細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk)的異常表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)的缺失、以及檢測(cè)點(diǎn)的異常等都將使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，細(xì)胞增殖失控，導(dǎo)致癌變。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年來(lái)揭示出的一類(lèi)長(zhǎng)度約為21～25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA(non-coding small RNA)，它們通過(guò)與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)或抑制靶蛋白的翻譯。大量證據(jù)表明，miRNAs可通過(guò)調(diào)控其靶基因參與的信號(hào)通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮著類(lèi)似于癌基因或抑癌基因的功能［1－2］。而某些miRNAs與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，它們可以通過(guò)靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促進(jìn)或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期，并且這種由miRNAs介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控方式與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3－5］。因此，闡明 miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所扮演的功能角色，尤其是其在人類(lèi)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制是一個(gè)值得深入研究的方向［6］。

1 細(xì)胞周期與腫瘤

細(xì)胞周期是一個(gè)由多種蛋白因子協(xié)同參與的復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)組成了最基本的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，負(fù)責(zé)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變和檢測(cè)點(diǎn)的完成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的分子主要包括cyclins、Cdks、CKI，以及抑癌基因編碼蛋白P53和pRb等。其中，cyclin和Cdk在細(xì)胞周期調(diào)控中起核心作用，cyclin是其對(duì)應(yīng)的cyclin-Cdk復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，其時(shí)相性表達(dá)是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵。這些蛋白在細(xì)胞周期運(yùn)行過(guò)程中又依次受到諸多蛋白質(zhì)(如 P53、P21、P16、CDC25 等)的調(diào)控。而 cyclin-Cdk復(fù)合物的下游底物又包括pRb和E2F等。此外，細(xì)胞內(nèi)還存在著其他一些調(diào)控點(diǎn)(如限制點(diǎn)或檢測(cè)點(diǎn))來(lái)確保細(xì)胞周期的正常運(yùn)行。

細(xì)胞周期紊亂是腫瘤最主要的發(fā)生機(jī)制，在細(xì)胞周期的整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，各類(lèi)分子的異常都有可能引起腫瘤。為了闡明腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的具體機(jī)制，科學(xué)家們從不同的角度對(duì)細(xì)胞周期與癌基因、抑癌基因、生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞增殖分化的關(guān)系進(jìn)行研究，以尋找控制細(xì)胞周期的神奇“開(kāi)關(guān)”，并從中篩選得到了一些具有細(xì)胞周期依賴性的重要基因［7－9］。上述研究不僅有助于發(fā)現(xiàn)更多參與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的靶標(biāo)分子，從細(xì)胞周期調(diào)控水平上闡明腫瘤的發(fā)病機(jī)制，而且為腫瘤的臨床診斷和治療提供了重要的線索和依據(jù)。

2 miRNAs與腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和大量miRNA的發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)小RNA在生物體內(nèi)的重要意義才被科學(xué)界廣為接受，并成為近10年來(lái)的研究熱點(diǎn)。據(jù)預(yù)測(cè)，人體內(nèi)大約有1 000多種miRNA分子，占人類(lèi)基因總數(shù)的1%左右。但它們不是由基因直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的，而是由RNA聚合酶Ⅱ首先從其編碼基因轉(zhuǎn)錄出較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)，然后在核內(nèi)由RNaseⅢ家族的Drosha和DGCR8形成的蛋白復(fù)合體剪切成長(zhǎng)度約為70 nt、帶發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的miRNA前體(pre-miRNA)［10］，并由 Exportin-5/Ran-GTP 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)［11］，最后在胞質(zhì)內(nèi)由RNaseⅢ家族的另一成員Dicer剪切加工成長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的成熟miRNA［12］，進(jìn) 一步 形 成 RNA 誘 導(dǎo) 沉 默 復(fù) 合 物(RNA-induced silencing complex，RISC)，結(jié)合到靶基因mRNA的3'UTR，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。

miRNA作為生物體內(nèi)一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)數(shù)百個(gè)靶基因，而不同的miRNA分子也可以協(xié)同調(diào)控同一mRNA分子。miRNA與其靶標(biāo)分子共同組成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制細(xì)胞內(nèi)多種重要的生命活動(dòng)［13］。這類(lèi)小分子RNA被譽(yù)為是“生物學(xué)中的暗物質(zhì)，存在于我們周?chē)鷧s幾乎逃脫了所有的視線”，它們的發(fā)現(xiàn)是對(duì)中心法則中RNA次要的中介角色的重要補(bǔ)充，必將促使生物學(xué)家重新思考細(xì)胞遺傳調(diào)控及其發(fā)育等方面的問(wèn)題。盡管對(duì)miRNA的研究還處于起步階段，但是據(jù)推測(cè)miRNAs在真核生物體內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要，它們可能代表了一種新的層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。正因?yàn)樵谏L(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、以及腫瘤等疾病發(fā)生中的重要作用，miRNAs領(lǐng)域的研究備受關(guān)注。

“癌microRNAs”(Oncomirs)這一嶄新概念的提出開(kāi)辟了將miRNAs應(yīng)用于腫瘤學(xué)相關(guān)研究的新篇章［14］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用［1，15］。而某些具有抑癌基因或癌基因功能的miRNAs分子可以通過(guò)直接靶向 E2F、Cdks、cyclins、CKI等促進(jìn)或阻滯細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而調(diào)控經(jīng)典的細(xì)胞周期信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，通常具有癌基因功能的 miRNAs 分 子 (如 miR-106-25［16］、miR-27a［17］、miR-221/222［18－19］、miR-17-92［20－21］等)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)升高可能通過(guò)促進(jìn)G1/S期的轉(zhuǎn)變，加速細(xì)胞周期進(jìn)程;而具有抑癌基因功能的miRNAs分子(如let-7 family［22］、miR-15/16［23－24］、miR-34 family［25－26］、miR-124/137［27－28］、miR-107［29］、miR-19a［30］等)在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)表達(dá)，則可能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，某些miRNAs還能與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子(如c-Myc、E2F、P53等)協(xié)同發(fā)揮作用，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子作用的同時(shí)又能抑制促增殖的細(xì)胞周期蛋白的過(guò)度表達(dá)［6］。這些研究充分提示，miRNAs亦是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分之一。因此，深入探討那些受到miRNAs調(diào)控的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，不僅詮釋了一個(gè)新的研究領(lǐng)域，而且有助于加深我們對(duì)經(jīng)典的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解，同時(shí)也將為揭示miRNA的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞周期紊亂的關(guān)系提供嶄新的思路。

3 miRNA的研究策略

相對(duì)于數(shù)量龐大的miRNA來(lái)說(shuō)，已知功能的miRNA還相對(duì)較少。隨著研究方法不斷發(fā)展和某些高通量的新技術(shù)的應(yīng)用，為探索miRNA世界的奧秘提供更多的選擇和幫助。

3.1 miRNA的鑒定

目前主要采用生物信息學(xué)方法和直接克隆的方法。miRNA克隆所依賴的結(jié)構(gòu)特征是其特異的5'端磷酸基團(tuán)與3'末端羥基基團(tuán)，以T4 RNA連接酶在分子末端加上連接子，再利用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得目的片段，克隆到合適的載體中，測(cè)序驗(yàn)證。所得到的小分子RNA需要生物信息學(xué)方法與分子生物學(xué)方法確認(rèn)，進(jìn)而注冊(cè)到miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)［31］。

3.2 miRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

目前研究miRNA表達(dá)的方法主要包括Northern blotting、實(shí)時(shí)定量PCR、RNA酶保護(hù)分析(ribonuclease protection assay，RPA)、磁珠流式檢測(cè)(bead-based flow cytometric assay)、原位雜交(in situ hybridistation)、高通量的 miRNA表達(dá)譜芯片(miRNA microarray)、miRNA深度測(cè)序(miRNA deep sequencing)等。

Northern雜交:類(lèi)似于經(jīng)典的mRNA檢測(cè)方法，但是過(guò)程相對(duì)煩瑣，且耗時(shí)費(fèi)力，對(duì)RNase污染非常敏感，且在檢測(cè)低豐度miRNA時(shí)欠靈敏。經(jīng)典的Northern雜交技術(shù)仍不可替代，特別是在驗(yàn)證芯片結(jié)果及降低其假陽(yáng)性方面起著至關(guān)重要的作用。

熒光定量PCR:可用于miRNA表達(dá)水平的定量檢測(cè)，且具有特異性高、靈敏度好、重復(fù)性好、快速簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，主要方法有莖環(huán)法［32］和加尾法［33］等。與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏地檢測(cè)出低豐度表達(dá)的靶分子，并適于高通量篩選。此法既可檢測(cè)小RNA前體，又可檢測(cè)成熟小RNA的表達(dá)。

RNA酶保護(hù)分析:是一種基于液相雜交的新方法，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，是Northern雜交的100倍。但由于價(jià)格昂貴，目前尚難于廣泛應(yīng)用。

磁珠流式檢測(cè):其原理是將結(jié)合探針的磁珠浸入到由兩種不同熒光染料組成的混合物中，RT-PCR法擴(kuò)增miRNA，產(chǎn)物與磁珠上的探針雜交，經(jīng)染色后用流式細(xì)胞儀對(duì)彩色磁珠計(jì)數(shù)，顏色代表特定的miRNA，信號(hào)強(qiáng)度則表示其豐度。此方法能更好地捕獲待測(cè)靶miRNA分子，最大程度地避免固態(tài)芯片中的交叉反應(yīng)，但需對(duì)磁珠進(jìn)行預(yù)先編碼和雜交后解碼，且成本較高。

原位雜交:可直觀了解miRNA的時(shí)空表達(dá)模式，常用地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等方式。鎖核苷酸(locked nucleic acid，LNA)探針因其與靶分子結(jié)合后可以增加異源雙鏈分子的熱力學(xué)穩(wěn)定性，提高反應(yīng)特異性，被廣泛用于原位雜交。

miRNA表達(dá)譜芯片:芯片無(wú)疑是高通量檢測(cè)miRNA表達(dá)情況的最佳選擇，它以雜交為基礎(chǔ)，目前已被廣泛用于特異組織或細(xì)胞內(nèi)miRNA表達(dá)譜的研究。此法對(duì)miRNA表達(dá)分析是間接的，在研究過(guò)程中仍存在特異性和靈敏度不高等缺點(diǎn)，因此結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性，需要輔助其他更為準(zhǔn)確的表達(dá)研究方法加以驗(yàn)證。

miRNA深度測(cè)序:熒光定量PCR和表達(dá)譜芯片局限于檢測(cè)已知 miRNA的表達(dá)，無(wú)法發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子。miRNA深度測(cè)序技術(shù)能夠直接對(duì)樣本中特定大小的miRNA分子進(jìn)行高通量測(cè)序，可以在無(wú)需任何miRNA序列信息的前提下研究miRNA的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 miRNA分子，為miRNA表達(dá)研究提供了更全面的方法，為進(jìn)一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

3.3 miRNA的功能研究

通?；蚬δ苎芯砍３２捎眠^(guò)表達(dá)或干涉(抑制、敲除)等方法，miRNA研究也不例外。前者通過(guò)提高該miRNA的表達(dá)水平，檢測(cè)過(guò)表達(dá)所引起的細(xì)胞表型變化，初步闡釋其可能的功能。體外合成雙鏈RNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)一步被Dicer加工，得到成熟的miRNA，可用于瞬時(shí)作用的研究。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究需構(gòu)建表達(dá)載體或選擇病毒載體，蛋白質(zhì)編碼的載體可用于miRNA細(xì)胞水平的表達(dá)研究，病毒載體則可以直接用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但是也有一定的局限性。需要注意的是，過(guò)表達(dá)研究中很難排除內(nèi)源性表達(dá)的影響，因此，要得到理想的結(jié)果往往還需要功能抑制(loss-of-function)或敲除該miRNA來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。

基于miRNA自身的特點(diǎn)，可以在基因水平上抑制miRNA的表達(dá)，也可采用反義核酸分子抑制其表達(dá)。前者如條件性敲除miRNA的加工因子Dicer，可得到所有成熟miRNA的缺失體，但此方法無(wú)法獲知單個(gè)miRNA的功能。在Dicer缺失情況下，單獨(dú)過(guò)表達(dá)某種miRNA即可直接用于其功能研究。采用反義核酸分子，如2'-O甲基修飾物、LNA修飾物、miRNA拮抗劑antagomir等與靶miRNA互補(bǔ)結(jié)合，可達(dá)到抑制miRNA表達(dá)的目的。2'-O-甲基修飾物可用于miRNA的體外功能研究，但若進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則須采用antagomir。它具有劑量依賴性，并可達(dá)到miRNA長(zhǎng)期抑制的效應(yīng)，而且不會(huì)影響同一基因簇內(nèi)其他miRNAs。

上述正反兩方面的研究相結(jié)合可很好地用于miRNA的功能研究。

3.4 miRNA 靶基因的鑒定

miRNA的功能研究很大程度上與其所調(diào)控的靶基因有關(guān)，鑒定miRNA的靶基因是該領(lǐng)域研究的重要內(nèi)容，同時(shí)也是難點(diǎn)。目前，靶基因的確定主要是以軟件預(yù)測(cè)為主，根據(jù)miRNA與靶基因3'UTR結(jié)合的結(jié)構(gòu)、熱動(dòng)力學(xué)等特點(diǎn)，借助生物信息學(xué)進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)。常見(jiàn)的靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)軟件有TargetScan、PicTar、TargetScanS、miRanda、RNA22、RNA-hybrid、RNAFold、DIANA-MicroT 等［34］。

生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的靶基因的數(shù)量往往要超過(guò)實(shí)際的數(shù)量，且存在假陽(yáng)性，因此需要通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)過(guò)表達(dá)和抑制所要研究的miRNA，借助熒光報(bào)告基因系統(tǒng)，可用于鑒定受到該miRNA調(diào)節(jié)的基因以及該miRNA所影響和調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程。導(dǎo)入化學(xué)合成的小分子miRNA mimics或拮抗劑antagomir，觀察靶mRNA及編碼蛋白表達(dá)以及細(xì)胞、動(dòng)物水平的表型變化，進(jìn)行信號(hào)通路研究，這是目前miRNA功能研究的常用方法。在確定了靶mRNA之后，找到位于3'UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)是研究者下一步關(guān)心的內(nèi)容。通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得候選的miRNA結(jié)合區(qū)域，將野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變的3'UTR序列克隆入熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)觀察miRNA對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響對(duì)結(jié)合位點(diǎn)加以驗(yàn)證。采用合適的報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA對(duì)其靶基因的調(diào)控作用，簡(jiǎn)便易行，但仍存在一定局限性，即不能完全模擬細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的調(diào)控環(huán)境。因此，當(dāng)探討特異miRNA在某一生理或病理過(guò)程中的功能，尋找其靶基因時(shí)，應(yīng)選擇合適的細(xì)胞模型或其他有效的實(shí)驗(yàn)工具，以真實(shí)體現(xiàn)miRNA的調(diào)控作用，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論與展望

隨著對(duì)非編碼RNA研究的不斷深入，它們?cè)诩?xì)胞周期信號(hào)通路中的生物學(xué)意義日益凸現(xiàn)。miRNA不僅可通過(guò)加快細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮促增殖效應(yīng)，而且也能阻滯細(xì)胞周期產(chǎn)生抗增殖效應(yīng)。一些miRNAs可能同時(shí)具有這兩方面的效應(yīng)，如miR-17-92簇中的部分miRNAs;另一些miRNAs則受細(xì)胞周期特異性轉(zhuǎn)錄因子(如c-Myc或E2F等)的調(diào)控?？梢?jiàn)，miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中作用具有復(fù)雜多樣性。miRNAs的功能研究很大程度上與靶基因的確定有關(guān)，然而此領(lǐng)域的研究進(jìn)展緩慢，很大程度上緣于目前尚無(wú)有效的大規(guī)模篩選并驗(yàn)證靶基因的方法。高通量的蛋白組學(xué)技術(shù)可能有助于此問(wèn)題的解決，從而加快靶基因驗(yàn)證的步伐［35－36］。此外，同一種miRNA在不同的細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，其靶基因也不盡相同，使其功能在細(xì)胞間存在較大差異。研究表明，miR-29b僅在細(xì)胞周期M期表達(dá)，其他階段不表達(dá)或表達(dá)較低，而miR-29a的表達(dá)在細(xì)胞周期各個(gè)階段均持續(xù)恒定地表達(dá)［37］，提示miRNAs的調(diào)控可能具有細(xì)胞周期特異性，但尚需進(jìn)一步探討。考慮到miRNAs在細(xì)胞周期調(diào)控及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要意義，上述問(wèn)題的解決將有助于進(jìn)一步完善細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

［1］Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，et al．miRNAs in human cancer［J］．J Pathol，2011，223:102 －115．

［2］Nikitina EG，Urazova LN，Stegny VN．MicroRNAs and human cancer［J］．Exp Oncol，2012，34:2 － 8．

［3］Guo X，Guo L，Ji J，et al．miRNA-331-3p directly targets E2F1 and induces growth arrest in human gastric cancer［J］．Biochem Biophys Res Commun，2010，398:1 －6．

［4］Lu J，He ML，Wang L，et al．miR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2［J］．Cancer Res，2011，71:225 －233．

［5］Xu T，Zhu Y，Xiong Y，et al．MicroRNA-195 suppresses tumorigenicity and regulates G1/S transition of human hepatocellular carcinoma cells［J］．Hepatology，2009，50:113 －121．

［6］Bueno MJ，Malumbres M．MicroRNAs and the cell cycle［J］．Biochim Biophys Acta，2011，1812:592 －601．

［7］Spellman PT，Sherlock G，Zhang MQ，et al．Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization［J］．Mol Biol Cell，1998，9:3273 －3297．

［8］ Cho RJ，Huang M，Campbell MJ，et al．Transcriptional regulation and function during the human cell cycle［J］．Nat Genet，2001，27:48 －54．

［9］Whitfield ML，Sherlock G，Saldanha AJ，et al．Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors［J］．Mol Biol Cell，2002，13:1977－2000．

［10］Lee Y，Ahn C，Han J，et al．The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing［J］．Nature，2003，425:415－419．

［11］Yi R，Qin Y，Macara IG，et al．Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs［J］．Genes Dev，2003，17:3011 －3016．

［12］Hutvagner G，McLachlan J，Pasquinelli AE，et al．A cellular function for the RNA-interference enzyme Dicer in the maturation of the let-7 small temporal RNA［J］．Science，2001，293:834 －838．

［13］Sethupathy P，Megraw M，Hatzigeorgiou AG．A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets［J］．Nat Methods，2006，3:881 －886．

［14］ Esquela-Kerscher A，Slack FJ．Oncomirs-microRNAs with a role in cancer［J］．Nat Rev Cancer，2006，6:259 －269．

［15］Cho WC．OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs in cancers［J］．Mol Cancer，2007，6:60．

［16］Ivanovska I，Ball AS，Diaz RL，et al．MicroRNAs in the miR-106b family regulate P21/CDKN1A and promote cell cycle progression［J］．Mol Cell Biol，2008，28:2167 －2174．

［17］Liu T，Tang H，Lang Y，et al．MicroRNA-27a functions as an oncogene in gastric adenocarcinoma by targeting prohibitin［J］．Cancer Lett，2009，273:233 －242．

［18］Fornari F，Gramantieri L，F(xiàn)erracin M，et al．miR-221 controls CDKN1C/p57 and CDKN1B/p27 expression in human hepatocellular carcinoma［J］．Oncogene，2008，27:5651－5661．

［19］Galardi S，Mercatelli N，Giorda E，et al．miR-221 and miR-222 expression affects the proliferation potential of human prostate carcinoma cell lines by targeting p27Kip1［J］．J Biol Chem，2007，282:23716－23724．

［20］Cloonan N，Brown MK，Steptoe AL，et al．The miR-17-5p microRNA is a key regulator of the G1/S phase cell cycle transition［J］．Genome Biol，2008，9:R127．doi:10．1186/gb-2008-9-8-r127．

［21］Wang Q，Li YC，Wang J，et al．miR-17-92 cluster accelerates adipocyte differentiation by negatively regulating tumor-suppressor Rb2/p130［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105:2889 －2894．

［22］Sampson VB，Rong NH，Han J，et al．MicroRNA let-7a down-regulates MYC and reverts MYC-induced growth in Burkitt lymphoma cells［J］．Cancer Res，2007，67:9762－9770．

［23］Chen RW，Bemis LT，Amato CM，et al．Truncation in CCND1 mRNA alters miR-16-1 regulation in mantle cell lymphoma［J］．Blood，2008，112:822 －829．

［24］Liu Q，F(xiàn)u H，Sun F，et al．miR-16 family induces cell cycle arrest by regulating multiple cell cycle genes［J］．Nucleic Acids Res，2008，36:5391 －5404．

［25］Sun F，F(xiàn)u H，Liu Q，et al．Downregulation of CCND1 and CDK6 by miR-34a induces cell cycle arrest［J］．FEBS Lett，2008，582:1564 －1568．

［26］Tazawa H，Tsuchiya N，Izumiya M，et al．Tumor-suppressive miR-34a induces senescence-like growth arrest through modulation of the E2F pathway in human colon cancer cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:15472－15477．

［27］ Furuta M，Kozaki KI，Tanaka S，et al．miR-124 and miR-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive microRNAs in hepatocellular carcinoma［J］．Carcinogenesis，2010，31:766 －776．

［28］Silber J，Lim DA，Petritsch C，et al．miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells［J］．BMC Med，2008，6:14．doi:10．1186/1741-7015-6-14．

［29］Feng L，Xie Y，Zhang H，et al．miR-107 targets cyclindependent kinase 6 expression，induces cell cycle G1 arrest and inhibits invasion in gastric cancer cells［J］．Med Oncol，2012，29:856 －863．

［30］Qin X，Wang X，Wang Y，et al．MicroRNA-19a mediates the suppressive effect of laminar flow on cyclin D1 expression in human umbilical vein endothelial cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107:3240 －3244．

［31］Michael MZ．Cloning microRNAs from mammalian tissues［J］．Methods Mol Biol，2006，342:189 －207．

［32］Chen C，Ridzon DA，Broomer AJ，et al．Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］．Nucleic Acids Res，2005，33:e179．doi:10．1093/nar/gni178．

［33］Raymond CK，Roberts BS，Garrett-Engele P，et al．Simple，quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs［J］．RNA，2005，11:1737 －1744．

［34］Maziere P，Enright AJ．Prediction of microRNA targets［J］．Drug Discov Today，2007，12:452 －458．

［35］Jovanovic M，Reiter L，Picotti P，et al．A quantitative targeted proteomics approach to validate predicted microRNA targets in C．elegans［J］．Nat Methods，2010，7:837－842．

［36］Mestdagh P，Bostrom AK，Impens F，et al．The miR-17-92 microRNA cluster regulates multiple components of the TGF-beta pathway in neuroblastoma［J］．Mol Cell，2010，40:762－773．

［37］Hwang HW，Wentzel EA，Mendell JT．A hexanucleotide element directs microRNA nuclear import［J］．Science，2007，315:97－100．