誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療脊髓損傷的現(xiàn)狀與展望＊

孟純陽

（濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟寧272029）

脊髓損傷是臨床上較為常見的一種創(chuàng)傷性疾病，由于現(xiàn)有治療方法效果不理想，常可引起病人不同程度的神經(jīng)功能的喪失甚至殘疾［1］。脊髓損傷的發(fā)病機理是一個非常復(fù)雜的過程，包括最初的機械損傷，然后是一系列的細(xì)胞和分子反應(yīng)組成的二次損傷包括谷氨酸細(xì)胞毒性，自由基生成，脂質(zhì)過氧化，炎癥反應(yīng)以及缺血等并最終導(dǎo)致壞死和凋亡。根據(jù)這些病理發(fā)生過程，已經(jīng)提出了幾種治療脊髓損傷的方法：1）使細(xì)胞死亡的進程最小化；2）通過移植或者刺激受損的脊髓產(chǎn)生新的細(xì)胞以替代丟失的細(xì)胞稱為神經(jīng)再生；3）重新將受損的神經(jīng)纖維和原來的目標(biāo)器官相連；4）通過改變連接性，使旁路的功能最大化；5）通過修復(fù)髓鞘使多余的神經(jīng)纖維功能最大化；6）使肌肉功能康復(fù)；7）使用假體或者機器人以及其它技術(shù)恢復(fù)功能。近年來，干細(xì)胞研究快速發(fā)展，在不遠的將來干細(xì)胞有可能應(yīng)用于脊髓損傷治療中的幾種或者全部的策略中［2］。

1 脊髓損傷治療的病理機制和治療現(xiàn)狀

脊髓損傷包括急性損傷和二次損傷，前者是由直接的機械傷害造成的不可逆損傷，后者是包括炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞壞死和凋亡、細(xì)胞毒性、細(xì)胞內(nèi)外離子不平衡、氧自由基、脂質(zhì)過氧化以及軸索反應(yīng)［3］。在脊髓損傷的早期階段，脊髓腫脹淤血，隨后脊髓局部缺血并導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域壞死。在早期的急性損傷期主要特征是炎癥反應(yīng)，自由基的產(chǎn)生，電解質(zhì)失衡，免疫相關(guān)的神經(jīng)毒性以及一些反應(yīng)，因此在此期間神經(jīng)保護干預(yù)非常重要。亞急性期的主要特征是細(xì)胞吞噬，大量的神經(jīng)細(xì)胞和組織碎片被吞噬，產(chǎn)生有利于軸突再生以及其它反應(yīng)的微環(huán)境，這個時期是干細(xì)胞移植的最好時期。亞急性期的最明顯特征是膠質(zhì)疤痕的形成以及軸突疤痕的形成。最后，在慢性期脊髓空洞或者瘺管的形成標(biāo)志著脊髓損傷進入穩(wěn)定期［4］。

脊髓損傷修復(fù)的困難主要是神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞壞死凋亡，臨近但未凋亡的細(xì)胞由于自身有限的再生能力不能有效的產(chǎn)生新的細(xì)胞。另一方面，局部微環(huán)境的改變導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖不平衡，例如產(chǎn)生形成軸突髓鞘的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增殖缺陷，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增生阻止了軸突的再生、軸突連接的建立以及功能的恢復(fù)［5］。

脊髓損傷的治療包括手術(shù)、藥物治療以及生物治療。在脊髓損傷早期，手術(shù)減壓以及脊柱穩(wěn)定性重建，對急性脊髓受壓的患者是有效改善脊髓損傷治療方法［6］。目前臨床常用的用于治療脊髓損傷的藥物多處于臨床試驗階段，這些藥物可以在脊髓損傷的急性期有效減少脊髓損傷的二次傷害，保護殘存的神經(jīng)組織。但迄今為止，藥物和手術(shù)治療并沒有得到滿意的結(jié)果，因為損傷的神經(jīng)細(xì)胞和軸突具有不可再生性，突觸連接很難重新建立［7］。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞移植作為生物治療的新方法為脊髓損傷的治療提供了新的希望。人臍帶血細(xì)胞無免疫原性，在脊髓損傷治療方面具有一定的潛力，安全、可行并且有效。但是對于臍帶血細(xì)胞的臨床研究比較少。最近，利用脂肪來源的干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效地解決細(xì)胞來源以及倫理等問題，但是這些細(xì)胞均一性比較差，需要新的技術(shù)以提高純度并擴增［8］。然而，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有其它細(xì)胞不具有的特性，例如多向分化潛能，來源廣泛，取樣簡單，無宿主免疫反應(yīng)以及無倫理與法律問題。

2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生物學(xué)特性

探求具有胚胎干細(xì)胞多向分化能力，并且具有患者個體化的種子細(xì)胞一直是再生醫(yī)學(xué)的主要目標(biāo)之一。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞由成體細(xì)胞去分化產(chǎn)生，具有多向分化能力，成體細(xì)胞來源于患者。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源于不同的細(xì)胞，通過重編碼技術(shù)使細(xì)胞表達幾個特異的轉(zhuǎn)錄因子。第一批誘導(dǎo)多能單細(xì)胞是通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct3／4，Sox2，Klf4和c－Myc基因輸送到小鼠的成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生的［9］?，F(xiàn)在可以通過一系列的方法產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞：1）病毒轉(zhuǎn)染：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以通過利用不同類型的病毒向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入不同類型或者不同量的轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生。但是這些外源性的基因傾向于整合到宿主基因組中，提高了成瘤的風(fēng)險性［10］。2）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：雖然質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也有可能整合到基因組中，但是可能性要比逆轉(zhuǎn)錄病毒小的多，所以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相對更安全［11］。3）游離性載體：利用游離性載體將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染進入成人細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后載體被清除，因此阻止了外源基因的整合［12］。4）易位系統(tǒng)：轉(zhuǎn)錄因子通過異位系統(tǒng)進入細(xì)胞，當(dāng)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞通過重編程產(chǎn)生后，轉(zhuǎn)座子被移位酶清除，因此誘導(dǎo)多能干細(xì)胞沒有外源基因的插入［13］。5）重組蛋白：成體細(xì)胞可以通過轉(zhuǎn)錄因子所編碼的蛋白發(fā)展成為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。這種方法比病毒和質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)運更安全，但是效率會降低［14］。6）化學(xué)方法：幾個實驗團隊通過化學(xué)物質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子成功地獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞［15］。7）RNA：誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以利用miRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生［16］。這種方法避免了轉(zhuǎn)染編碼以上所提到的轉(zhuǎn)錄因子的基因，是一種安全有效的產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。但是產(chǎn)生率依然很低。我們希望通過不斷的革新誘導(dǎo)方法，能夠在不久的將來可以高效安全的產(chǎn)生誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

多向分化能力是誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的主要特點，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠分化成3個胚層以及各種不同的細(xì)胞。最初的研究表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞有許多相同之處，例如形態(tài)，增殖，表達胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因，畸胎瘤形成。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源于接受者，可以避免胚胎干細(xì)胞在臨床應(yīng)用中所產(chǎn)生的倫理和法律問題。同時，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源廣泛，量大，容易獲取。

3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和脊髓損傷治療

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在體外可以產(chǎn)生具有功能的神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。不同成體組織來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞對神經(jīng)誘導(dǎo)信號的反應(yīng)性以及成瘤性各不相同。在組織挫傷的第九天將神經(jīng)球移植到脊髓可以分化成3種神經(jīng)細(xì)胞系，沒有產(chǎn)生畸胎瘤，并且參與了髓鞘再生。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的機制主要是：移植細(xì)胞重建神經(jīng)突出連接，少突觸細(xì)胞使脫髓鞘軸突再生髓鞘，移植細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)生長因子。將人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)球移植到聯(lián)合免疫缺陷小鼠中，移植的神經(jīng)球在損傷的脊髓中存活，遷移分化成3種主要的神經(jīng)細(xì)胞系。同時觀察到細(xì)胞自發(fā)的以及非細(xì)胞自發(fā)的效應(yīng)，包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)細(xì)胞與小鼠自身神經(jīng)突觸連接的建立，神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，血管的生成，軸突的再生以及受損區(qū)域髓磷脂的再生。2008年哈佛大學(xué)的Dimos等［17］通過對一位患有家族性脊髓側(cè)索硬化癥的患者的成纖維細(xì)胞進行誘導(dǎo)，成功地獲得了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并進一步將其誘導(dǎo)分化成運動神經(jīng)元，而運動神經(jīng)元是脊髓損傷時被破壞的細(xì)胞種類之一。Tsuji等［18］將人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化產(chǎn)生的神經(jīng)上皮樣細(xì)胞移植到聯(lián)合免疫缺陷小鼠受損的脊髓中，細(xì)胞存活并且分化為神經(jīng)細(xì)胞，促進了小鼠后肢的功能恢復(fù)。該結(jié)果表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植可以提高甚至恢復(fù)脊髓損傷小鼠的功能。將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)球在脊髓損傷的第九天的亞急性期移植到聯(lián)合免疫缺陷小鼠的體內(nèi)。研究表明神經(jīng)球分化為神經(jīng)元（31.4±1.1）%，星形膠質(zhì)細(xì)胞（49.3±4.5）%，少突細(xì)胞（14.4±3.0）%，表明幾乎所有的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的神經(jīng)球都分化為了神經(jīng)細(xì)胞。在受損的脊髓中發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)營養(yǎng)因子改變，髓鞘脫失，但是當(dāng)移植神經(jīng)球后狀況得到明顯改善。同時在42d后觀察發(fā)現(xiàn)有髓鞘區(qū)神經(jīng)球移植與對照組分別為（0.19±0.029）mm2和（0.046±0.012）mm2。

4 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷治療存在的問題

雖然誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在治療脊髓損傷方面表現(xiàn)出了許多突出的優(yōu)點，但是推動其在脊髓損傷臨床治療方面的應(yīng)用，尚有許多問題需要解決：1）提高獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率。目前獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率依然很低，而較低的獲取效率無疑會阻礙誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。2）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的來源，來源于不同組織的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞效率以及安全性不完全相同。因此選擇合適的細(xì)胞來源比較重要。3）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)［19］。起初廣泛認(rèn)為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞沒有免疫排斥反應(yīng)，但是進一步的研究表明誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有免疫原性。4）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的安全性。眾所周知如果移植沒有分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能引起畸胎瘤的形成。雖然流式細(xì)胞術(shù)可以分選出分化與未分化的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而阻止移植后畸胎瘤的形成，但是此種方法不能滿足臨床上對大量誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的需求。DNA甲基化和表型分析發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞存在一定的差別。病毒介導(dǎo)的基因輸送具有外源基因整合的風(fēng)險。5）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用于臨床脊髓損傷治療。至今還沒有研究顯示究竟多少數(shù)量的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞用于移植可以達到較好的效果，太多或者太少的移植都可能導(dǎo)致移植的失敗。干細(xì)胞移植治療后形成的不正常的連接有可能會引起痛覺過敏。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的移植治療方法仍有待進一步研究。

5 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷治療的展望

胚胎干細(xì)胞已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于脊髓損傷治療的一期臨床試驗［20］。與胚胎干細(xì)胞相比誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有很多優(yōu)勢，在不久的將來誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能應(yīng)用于脊髓損傷的臨床治療。最近的研究表明成纖維細(xì)胞可以經(jīng)過重編碼直接成為神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞，也就意味著誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的中間態(tài)被省略［20］。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞應(yīng)用于脊髓損傷的治療方式可能被改變，成體干細(xì)胞通過誘導(dǎo)直接分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，從而避免誘導(dǎo)多能干細(xì)胞癌變的風(fēng)險［22－24］。雖然這種方法的轉(zhuǎn)化效率比較低，但它無疑為干細(xì)胞移植用于脊髓損傷的治療提供了突破口［25－27］。運用確定的因子將小鼠和人的成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為運動神經(jīng)元，能夠在體內(nèi)分化成具有功能的神經(jīng)細(xì)胞。雖然直接重編程技術(shù)為脊髓損傷治療提供了新的治療方法，進一步優(yōu)化大規(guī)模準(zhǔn)備臨床級和個體特異性可移植的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法仍然很有前景。

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