EBVaGC中LMP1和BHRF1的表達(dá)與血管生成淋巴管生成的關(guān)聯(lián)性研究

張 偉 王愛(ài)亮 崔 凱 孫 靜 李 勝△

（1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250062；2山東省腫瘤防治研究院，濟(jì)南250117；3濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)寧272029）

EB病毒（Epstein－Barr virus，EBV）與人類(lèi)多種惡性腫瘤有關(guān)，例如Burkitt淋巴瘤（BL）、Hodokin?。℉D）、鼻咽癌（NPC）及胃癌（GC）等［1］，胃癌細(xì)胞內(nèi)存在EBV者定義為EBV相關(guān)性胃癌（EBVaGC）。EB病毒潛伏膜蛋白基因（LMP1）和EB病毒早期編碼基因（BHRF1）是公認(rèn)的病毒致癌基因，EBV編碼的BHRF1蛋白在約90%EBVaGC組織中可檢測(cè)到，但未發(fā)現(xiàn)LMP1的表達(dá)［2－3］。因此，我們收集EBV相關(guān)胃癌組織，利用免疫組化方法檢測(cè)LMP1、BHRF1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF－C）、淋巴細(xì)胞內(nèi)皮標(biāo)記物（LYVE－1）和高度糖基化的i型跨膜糖蛋白（CD34）的表達(dá)情況，探討與臨床病理的關(guān)系，從而初步了解其在EBVaGC中發(fā)生的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所有患者均來(lái)自山東省籍貫并且三代居住在山東省內(nèi)的當(dāng)?shù)貪h族人群。所有病例均取自山東省腫瘤防治研究院和濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2008年至2012年的手術(shù)標(biāo)本，采用標(biāo)本均簽署知情同意書(shū)。胃癌手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本600例（含石蠟包埋組織），選取經(jīng)原位分子雜交檢測(cè)鑒定EB病毒相關(guān)性胃癌30例。

1.2 方法

1.2.1 病理標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋。所有標(biāo)本均以4μm連續(xù)切片，LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34單克隆抗體按1∶200稀釋，以下操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，最后DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色，常規(guī)復(fù)染封片。用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替上述抗體作陰性對(duì)照。其中一張用蘇木精－伊紅染色，光鏡觀察進(jìn)行組織病理學(xué)分類(lèi)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)（SP法） 我們應(yīng)用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素（Streptavidin Peroxidase，SP）免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)上述標(biāo)本中LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 試劑 LMP1、BHRF1、VEGF－C、LYVE－1和CD34單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限 公 司（DAKO Cytomation，Glostrup，Denmark），均為濃縮型產(chǎn)品。S－P試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。用已知的乳腺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.4 結(jié)果判定 閱片由兩位病理科醫(yī)師分別雙盲閱片，LMP1、BHRF1、VEGF－C均以細(xì)胞膜或胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)；VEGF－C以細(xì)胞膜和／或胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每例切片至少計(jì)數(shù)10個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞25%為陽(yáng)性，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例分為：＜10%（－），11%～25%（＋），25%～50%（?），＞50%（?）。染色強(qiáng)度判定：不著色（－），淺棕黃色（＋），棕黃色（?），棕褐色（?）。綜合陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析。

采用抗CD34多克隆抗體標(biāo)記微血管內(nèi)皮細(xì)胞，其標(biāo)記的微血管的結(jié)果判定如下：先在低倍（×100倍）鏡下全面觀察切片，尋找微血管高密度區(qū)，在400倍視野下，以與周?chē)[瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成分有明顯區(qū)別的、任何一個(gè)染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也作為一個(gè)血管進(jìn)行計(jì)數(shù)；但管腔＞8個(gè)紅細(xì)胞大小或帶有肌層的血管均不計(jì)數(shù)。記錄5個(gè)高倍視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為每例的微血管密度（MVD）。

同樣通過(guò)免疫組織化學(xué)方法顯色，微淋巴管在光鏡下為棕黃色細(xì)長(zhǎng)管壁包繞的條索狀或不規(guī)則形的管腔，以抗LYVE－1單克隆抗體標(biāo)記微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，其標(biāo)記的微淋巴管的結(jié)果判定如下：在低倍鏡（×100倍）下尋找LYVE－1陽(yáng)性脈管密集區(qū)，換高倍鏡（×400倍）選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其平均值計(jì)算微淋巴管密度（MLVD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的LMP1、BHRF1、VEGF－C的表達(dá)比較及MVD和MLVD量的比較

LMP1位于細(xì)胞膜上及胞漿中，呈棕色顆粒狀分布，胞核陰性，30例EBVaGC中6例弱陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%。BHRF1位于細(xì)胞膜上及胞漿中，呈棕色顆粒狀分布，30例EBVaGC中20例呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為66.67%。VEGF－C表達(dá)陽(yáng)性在鏡下均表現(xiàn)為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，19例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為63.33%。

免疫組織化學(xué)染色中CD34主要定位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，組織中微血管形態(tài)不規(guī)整，分布不均；癌灶邊緣血管較密集，成簇狀，部分呈發(fā)芽狀，管腔相對(duì)規(guī)則，但微血管分布不均。

微淋巴管在光鏡下為棕黃色細(xì)長(zhǎng)管壁包繞的條索狀或不規(guī)則形的管腔，LYVE－1主要表達(dá)在癌巢周?chē)g質(zhì)脈管內(nèi)皮細(xì)胞。癌巢組織內(nèi)的淋巴管分布少，且管徑?。话┡灾?chē)M織淋巴管分布相對(duì)于癌巢內(nèi)多，呈不規(guī)則形，并且有大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。MLVD陽(yáng)性脈管多呈管腔狀、條索狀彌漫或散在分布在癌巢周?chē)g質(zhì)，?？梢?jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)。

LMP1在30例EBVaGC中6例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%。不同TNM分期的LMP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移的LMP1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BHRF1有20例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為66.67%，不同TNM分期的BHRF1表達(dá)陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移的BHRF1表達(dá)陽(yáng)性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示BHRF1表達(dá)和TNM分期級(jí)、有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)。VEGF－C 19例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為63.33%，有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移的VEGF－C蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示VEGF－C蛋白的表達(dá)與EBVaGC的周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）有關(guān)聯(lián)（表1）。

2.2 形態(tài)計(jì)量學(xué)圖像分析法測(cè)定MVD、MLVD結(jié)果比較

EBVaGC中MVD在不同性別、有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而在不同的TNM分期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。形態(tài)計(jì)量學(xué)圖像分析法測(cè)定MLVD發(fā)現(xiàn)，EBVaGC中MLVD在不同TNM分期和有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

2.3 BHRF1和VEGF－C的表達(dá)與MVD及MLVD之間的關(guān)系

30例EBVaGC組織中BHRF1陽(yáng)性表達(dá)者的MVD與陰性組無(wú)差別，說(shuō)明BHRF1的表達(dá)與MVD無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)的關(guān)聯(lián)，而與MLVD有統(tǒng)計(jì)學(xué)的關(guān)聯(lián)。在VEGF－C陽(yáng)性表達(dá)的19例EBVaGC組織中，MVD和MLVD均明顯高于陰性組，兩組比較其差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明VEGF－C可能參與EBVaGC的血管和淋巴管生成，其高表達(dá)間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞沿新生的淋巴管遷徙和轉(zhuǎn)移（表3）。

表1 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的LMP1、BHRF1和VEGF－C表達(dá)比較

表2 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的MVD和MLVD比較（±s）

表2 3種EBVaGC臨床病理因素不同水平的MVD和MLVD比較（±s）

臨床病理因素 n MVD t P MLVD t P性別 男54.91±5.84女16 14 57.08±6.42 0.97 0.3402 6.22±4.08 8.17±2.12 1.6 0.1198 TNM分期 Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ13 17 52.28±5.83 58.71±4.82 －3.31 0.0026 4.67±3.10 9.02±2.26 －4.45 0.0001淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性陽(yáng)性9 54.14±6.69 21 56.69±5.85 －1.05 0.3040 4.98±3.49 8.06±2.99－2.46 0.0205

表3 不同BHRF1和VEGF－C水平MVD、MLVD表達(dá)情況的比較（±s）

表3 不同BHRF1和VEGF－C水平MVD、MLVD表達(dá)情況的比較（±s）

n MVD t P MLVD t P BHRF1表達(dá) 陰性陽(yáng)性10 20 29.00±15.08 0.31 0.7625 4.72±1.79 8.95±3.63 30.60±9.49－3.46 0.0018 VEGF－C表達(dá) 陰性陽(yáng)性11 19 36.09±10.80 －4.63＜0.0001 4.59±1.75 8.99±3.73 18.20±9.04－3.67 0.001

3 討論

EBVaGC是一個(gè)新出現(xiàn)的概念，因胃癌細(xì)胞中存在EB病毒而得名。據(jù)估計(jì)，全球每年新增EBVaGC患者多于80萬(wàn)人［4］，而全球10%的胃癌病例被證實(shí)與EB病毒相關(guān)［5］。EBVaGC在臨床上表現(xiàn)為以男性為主，發(fā)病年齡較小，多發(fā)生在胃上部和胃體部，腫瘤直徑較小。EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，5年存活率可達(dá)66.2%，比EB病毒非相關(guān)性胃癌（EBVnGC）高［6］。

LMP1是EB病毒編碼的一種6次跨膜蛋白，與細(xì)胞粘附性改變、細(xì)胞外基質(zhì)降解和腫瘤血管生成等均有密切的聯(lián)系［7］。EBVaGC為I型潛伏感染，表達(dá)EBNA1，EBERs和BARF0，部分病例表達(dá)LMP2A4種I型潛伏感染基因，而不表達(dá)LMP1和EBNA2［8］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在30例EBVaGC中6例呈弱陽(yáng)性（陽(yáng)性率20%），與性別、分期及有無(wú)周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，說(shuō)明在EBVaGC中LMP1呈低表達(dá)，對(duì)EBVaGC發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移作用有限。

BHRF1屬EB病毒早期抗原，在EB病毒溶解復(fù)制周期的早期大量表達(dá)，和Bcl－2具有部分相同的蛋白序列，可能與Bcl－2一樣能延緩細(xì)胞的終末分化，增加抵抗DNA損傷藥物和促進(jìn)細(xì)胞在無(wú)血清情況下生存，從而抑制細(xì)胞凋亡［9］。在本次試驗(yàn)中，我們通過(guò)對(duì)30例EBVaGC標(biāo)本的免疫組化染色證實(shí)，BHRF1在30例EBVaGC中20例陽(yáng)性（陽(yáng)性為66.67%），其高表達(dá)與TNM分期和周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，表明BHRF1高表達(dá)可能促進(jìn)EBVaGC病情進(jìn)展。

本文通過(guò)形態(tài)計(jì)量學(xué)圖像分析法測(cè)定MLVD，發(fā)現(xiàn)在EBVaGC中MLVD與TNM分期和周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切（表2），而20例BHRF1陽(yáng)性患者與10例BHRF1陰性患者中MLVD平均值亦存在顯著差異，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況吻合。但形態(tài)計(jì)量學(xué)圖像分析法測(cè)定的MVD與TNM分期顯著相關(guān)，而與性別、周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推論EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與BHRF1的高表達(dá)可能抑制EBVaGC周?chē)馨娃D(zhuǎn)移有關(guān)。

通過(guò)免疫組化與組織學(xué)觀察對(duì)EBVnGC（EB病毒非相關(guān)性胃癌）與EBVaGC病理切片進(jìn)行比較，結(jié)果表明EBVnGC組織中微血管形態(tài)不規(guī)整，分布不均，以癌腫邊緣為主，而EBVaGC腫瘤微環(huán)境中，微血管和微淋巴管的增生較少，因而可能減少其淋巴轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，該發(fā)現(xiàn)與臨床EBVaGC較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦相符。

VEGF－C是新近鑒定出的淋巴管生長(zhǎng)因子，也是酪氨酸激酶受體（VEGFR－3／fit－4）的特異性配體，能通過(guò)選擇性地誘導(dǎo)淋巴管生成促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移播散［10］。

目前關(guān)于VEGF－C的研究在鼻咽癌等頭頸部腫瘤中已較為深入，大量研究提示其表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［11］，EBV編碼的LMP1蛋白可以通過(guò)直接或間接的方式上調(diào)VEGF－C的表達(dá)，從而對(duì)鼻咽癌的淋巴轉(zhuǎn)移及發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用［12］。而本次實(shí)驗(yàn)以胃癌患者為研究對(duì)象，在EBVaGC標(biāo)本中對(duì)比19例VEGF－C陽(yáng)性標(biāo)本和11例VEGF－C陰性標(biāo)本的微血管和微淋巴管生成情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19例VEGF－C陽(yáng)性表達(dá)EBVaGC中，MVD和MLVD均明顯高于陰性組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示VEGF－C表達(dá)水平的上調(diào)可能與微血管和微淋巴管增生關(guān)系密切（表3），可能參與EBVaGC的血管和淋巴管生成，其高表達(dá)間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞沿新生的淋巴管遷徙和轉(zhuǎn)移。

目前已知在鼻咽癌中LMP1存在高表達(dá)，它與VEGF的表達(dá)和鼻咽癌的侵襲性、血管生成密切相關(guān)。而在本研究中發(fā)現(xiàn)EBVaGC中存在LMP1低表達(dá)和BHRF1高表達(dá)，與鼻咽癌存在差異。而EBVaGC和NPC中侵襲性、血管生成和淋巴管生成的差異是否與LMP1和BHRF1的表達(dá)差異有關(guān)，LMP1和BHRF1的表達(dá)在EBVaGC和NPC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，甚至以及EBVaGC和NPC中的侵襲性、血管生成和淋巴管生成關(guān)系等分子機(jī)理等，仍有待進(jìn)一步研究。

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