吉祥草藥材抗炎、止咳作用及譜效關(guān)系

金兆磊 ， 趙 超 ， 陳華國 ， 周 欣 *， 楊世林

（1.貴州師范大學(xué) 天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴州 貴陽 550001；2.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點實驗室，貴州 貴陽 550001）

藥用吉祥草為百合科吉祥草屬植物吉祥草（Reineckia carnea（Andr.）Kunth）的干燥全草，史載于隋唐時期陳藏器《本草拾遺》，在《本草綱目》《中藥大辭典》等中均有記載。吉祥草又名觀音草、小葉萬年青、瑞草等，具有清肺止咳、解毒利咽、涼血止血、止痛散瘀等功效。其主要分布在我國華東、中南、西南各省，它是我國苗族地區(qū)常用的傳統(tǒng)草藥之一[1]。

國內(nèi)外關(guān)于吉祥草藥材藥理的研究報道不多，關(guān)于吉祥草藥材的抗炎活性、止咳活性研究更是少見。張元[2]等人研究發(fā)現(xiàn)，吉祥草總皂苷灌胃給藥能夠抑制氨水引起的小鼠咳嗽，總皂苷皮下注射給藥具有較好的抗炎作用；Nan Han[3]等人利用水溶劑回流提取吉祥草藥材，得到母液部分，另外將母液通過柱層析（D-101大孔樹脂）梯度洗脫，得到不同部位。分別為:水、體積分?jǐn)?shù)30%乙醇、體積分?jǐn)?shù)60%乙醇及體積分?jǐn)?shù)90%乙醇洗脫部分。通過藥理實驗，發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)60%、體積分?jǐn)?shù)90%乙醇洗脫部位具有明顯的止咳、化痰效果。因此，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)吉祥草藥材抗炎、止咳活性部位，本實驗中利用不同極性溶劑提取藥材，通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹和小鼠氨水引咳經(jīng)典實驗方法篩選，初步確定吉祥草材抗炎、止咳有效活性部位。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由長沙東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供（SPF級），許可證號:SCXK（湘）2009-0012。

1.2 藥物

吉祥草藥材，采于貴州貴陽小河區(qū)，原植物經(jīng)貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制中心陳華國副研究員鑒定為百合科吉祥草（Reineckia carnea（Andr）Kunth.）。

1.3 藥物制備

取上述3份吉祥草干藥材粗粉各50 g，精密稱定，分別加入10倍量蒸餾水、食用酒精及石油醚，加熱回流提取2次，每次2 h，合并2次濾液，減壓濃縮至干，精密稱定，計算各溶劑提取物得膏率:石油醚提取得率1.5%，食用酒精提取得率23.2%，水提取得率43.3%。

阿司匹林，規(guī)格:25 mg×100片，神威藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號:1103052；磷酸可待因口服液Ⅲ，規(guī)格:每5 mL含磷酸可待因4 mg、鹽酸麻黃堿5 mg、馬來酸氯苯那敏2.5 mg、遠(yuǎn)志流浸膏20.5 μL、海蔥流浸膏 9.0 μL、克斯蘭納流浸膏 4.5 μL，香港萬輝藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號:110401。

1.4 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，1260 Infintiy蒸發(fā)光散射檢測器 （G4218A），AL 204萬分之一電子分析天平，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；402 AI型超聲霧化器，江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司產(chǎn)品；DFY-200型高速萬能粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品；氨水、二甲苯，均為分析純試劑，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

2 方法

2.1 抗炎活性部位的研究

二甲苯致小鼠耳廓腫脹[4]。取小鼠110只，雌雄各半，隨機(jī)分成11組:生理鹽水對照組（空白組），石油醚提取物高、中、低劑量組，食用酒精提取物高、中、低劑量組，水提取物高、中、低劑量組（生藥量 7.50、3.25、1.63 g/kg），阿司匹林陽性對照組。 陽性藥按300 mg/kg藥量給藥，其余給藥組按相應(yīng)劑量給藥，每日1次，給藥體積按20 mL/kg，連續(xù)給藥7 d。末次給藥45 min后，于小鼠右耳均勻涂二甲苯40 μL致炎，左耳不涂為正常耳。15 min后脫頸處死，將左、右兩耳片切下，以8 mm打孔器取下左、右耳片，立即用天平稱質(zhì)量（mg），計算左右耳腫脹度及抑制率，比較各組之間的抗炎活性差異。

2.2 止咳活性部位研究

氨水引咳法[4]。取小鼠80只，雌雄各半，隨機(jī)分成8組:生理鹽水對照組（空白組），石油醚提取物高、低劑量組，食用酒精提取物高、低劑量組，水提取物高、低劑量組（生藥量 7.50、1.63 g/kg），磷酸可待因口服液陽性對照組。陽性藥按15 mL/kg藥量給藥，其余給藥組按相應(yīng)劑量給藥，每日1次，給藥體積按20 mL/kg，連續(xù)給藥6 d。末次給藥1 h后，按氨水氣霧引咳法，用超聲霧化器霧化氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%氫氧化銨），使霧化氨水均勻地噴入倒扣的500 mL容積密閉玻璃鐘罩內(nèi)，然后迅速將小鼠放入充滿氨水霧氣的鐘罩內(nèi)，噴霧5 s，以小鼠收縮腹部并張口作為咳嗽指標(biāo)，記錄咳嗽潛伏期和開始咳嗽后2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)。

2.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2.4 吉祥草不同極性提取物HPLC-ELSD指紋圖譜

液相色譜條件:Diamonsil（R）C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；ELSD 檢測器:漂移管溫度85℃，氮氣壓力350 kPa，增益值為6。流動相為乙腈（B）-水（A）溶液梯度洗脫，具體質(zhì)量分?jǐn)?shù)如下:0～5 min，10%B；5～8 min，10%～25%B；8～15 min，25%B；15～25 min，25%～27%B；25～27 min，27%～30%B；27～35 min，30%～37%B；35～55 min，37%～42%；55～60 min，42%～65%B；60～70 min，65%～95%B；體積流量 0.8 mL/min，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 30 μL。

取吉祥草藥材不同極性提取物（換算成等量生藥材），在上述色譜條件下，分別注入液相色譜儀，記錄80 min色譜圖，見圖1，通過與對照品色譜圖的比較，圖中16號峰為凱提5-O-β-D-吡喃葡萄糖皂苷，17號峰為1，6-二羥基-8-甲基-口山酮。

3 結(jié)果與分析

3.1 對二甲苯致小鼠耳廓腫脹度的影響

實驗結(jié)果表明，食用酒精提取物3個劑量組、水提物3個劑量組及陽性給藥組對小鼠耳廓腫脹均有明顯的抑制作用，其中食用酒精提取物高劑量組抑制率高達(dá)到70%，以上各組與空白對照組比較，差異顯著（P＜0.05），說明具有較好的抗炎作用；石油醚提取物各組均沒有明顯作用，結(jié)果見表1。

圖1 不同溶劑提取物HPLC-ELSDFig.1 HPLC-ELSD of different solvent extract

表1 不同給藥組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響Table 1 Effect of different drug groups on xyleneinduced mouse ear swelling ±s，n=10

表1 不同給藥組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響Table 1 Effect of different drug groups on xyleneinduced mouse ear swelling ±s，n=10

注:與空白對照組比較 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 劑量/(mg/kg)耳廓腫脹度/mg抑制率/%空白對照組 - 5.28±1.66陽性給藥組 300.00 2.22±0.43*** 58石油醚高劑量組 115.20 3.54±0.66 33石油醚中劑量組 57.60 3.56±0.72 33石油醚低劑量組 28.80 3.60±1.08 32食用酒精高劑量組 1737.20 1.57±0.56*** 70食用酒精中劑量組 868.60 2.19±0.50*** 59食用酒精低劑量組 434.30 2.31±0.62*** 56水提高劑量組 3247.80 2.11±0.42** 60水提中劑量組 1623.90 2.84±0.52* 46水提低劑量組 811.95 3.21±0.56* 39

3.2 對氨水氣霧致小鼠咳嗽的影響

實驗結(jié)果表明，食用酒精提取物高、低劑量組均能延長小鼠咳嗽潛伏期（P＜0.05），高劑量組還能明顯減少咳嗽次數(shù)（P＜0.05），說明食用酒精提取物具有較好的止咳作用；水提物高劑量組能夠延長咳嗽潛伏期（P＜0.05），減少咳嗽次數(shù)（P＜0.05），同樣具有止咳作用；石油醚提取物沒有明顯的止咳活性。結(jié)果見表 2。

表2 不同給藥組對氨水所致小鼠咳嗽的影響Table 2 Effect of different drug groups on cough of mice induced by ammonia ˉ±s，n=10

表2 不同給藥組對氨水所致小鼠咳嗽的影響Table 2 Effect of different drug groups on cough of mice induced by ammonia ˉ±s，n=10

注:與空白對照組比較 *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 劑量/(mgkg) 咳嗽潛伏期/s 咳嗽次數(shù)空白對照組 - 25.65±5.65 9.14±2.34陽性給藥組 - 59.77±7.80*** 3.43±0.57***石油醚高劑量組 115.20 30.15±6.22 7.71±1.70石油醚低劑量組 28.80 19.02±3.06 8.00±1.63食用酒精高劑量組 1737.20 62.56±12.22* 4.20±0.39**食用酒精低劑量組 434.30 54.23±7.93* 5.83±1.72水提高劑量組 3247.80 55.74±7.76*** 5.56±1.33*水提低劑量組 811.95 37.72±7.56 9.00±1.29

4 結(jié)語

文獻(xiàn)報道，吉祥草藥材中主要含有甾體類、皂苷類化合物[5]。藥材經(jīng)不同極性溶劑提取后，其化學(xué)成分按極性大小集中，由圖1可知，水提物化學(xué)成分集中在Ⅰ部分，醇提取物化學(xué)成分主要分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分。結(jié)合藥理數(shù)據(jù)，醇提取物具有較好的抗炎、止咳活性。由此可知，具有活性作用的化學(xué)成分很有可能集中在Ⅱ、Ⅲ部分。水提物高劑量組同樣具有較好的抗炎、止咳活性，這很有可能是不同類型化學(xué)成分具有相同的活性。

通過不同極性提取溶劑篩選吉祥草藥材的抗炎、止咳生物活性部位。結(jié)果顯示，醇提物、水提物都具有較好活性，石油醚提取物沒有明顯效果，說明吉祥草藥材中起活性作用的化學(xué)成分主要為極性相對較大的化合物。為進(jìn)一步分析藥材中化學(xué)成分，在相同的色譜條件下，對其進(jìn)行HPLC-ELSD分析，初步將藥理數(shù)據(jù)與HPLC-ELSD結(jié)合，為下一步吉祥草藥材藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其“譜效”關(guān)系研究提供理論參考依據(jù)，這將有利于吉祥草藥材及其相關(guān)藥品更深入的研究與開發(fā)。

[1]邱德文，杜江.中華本草·苗藥卷[S].貴陽:貴州科技出版社，2005:254.

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[4]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:347，626.

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