百草枯半抗原分子設(shè)計(jì)合成及表征

管 露， 張銀志*， 楊婷婷， 尤繼明， 李紅梅， 孫秀蘭

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江蘇蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫214068；3.國家有機(jī)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

百草枯（paraquat，PQ）又名克無蹤、對草快，化學(xué)名為1，1'-二甲基-4，4'-聯(lián)吡啶陽離子鹽，它是一種廣譜、滅生性有機(jī)雜環(huán)類除草劑，主要防治玉米、大豆、蔬菜、水稻、果園等地的雜草，也用作谷類、棉花、甘蔗等收割前的脫葉劑，它對植物綠色組織具有較強(qiáng)的破壞作用[1]。百草枯可經(jīng)胃腸道、皮膚和呼吸道吸收。有研究顯示，使用百草枯除草的農(nóng)民長期吸入小劑量百草枯易導(dǎo)致肺纖維化[2]。由于百草枯的廣泛應(yīng)用，有可能會存在于糧油作物和一些食品原料中，即使在非致害水平下，也會對人體健康產(chǎn)生潛在危害。

農(nóng)藥免疫分析法不但具有與常規(guī)分析法相當(dāng)或更高的靈敏度，而且無須使用昂貴儀器設(shè)備，方法簡便快速，在農(nóng)藥殘留的快速篩選和定量檢測以及現(xiàn)場和快速檢測方面已顯示出獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，受到環(huán)境監(jiān)測工作者的重視。酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測百草枯殘留的研究，國外已有報(bào)道[3-8]，國內(nèi)相關(guān)報(bào)道極少[9-10]。百草枯的分子量僅為257 Da，屬于半抗原，只具有反應(yīng)原性，而無免疫原性。由于百草枯自身沒有可供偶聯(lián)的活性官能團(tuán)（如氨基、羧基等），因此，必須對百草枯分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使其具有活性基團(tuán)——羧基，然后與大分子載體蛋白質(zhì)交聯(lián)，才能刺激動物產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。由于百草枯分子結(jié)構(gòu)中，聯(lián)吡啶環(huán)上兩氮原子均連有甲基，不易直接連入帶有一段碳連的羧基。為此，作者選取百草枯的結(jié)構(gòu)類似物—4，4’-聯(lián)吡啶，通過控制反應(yīng)先在其一側(cè)氮原子上加入甲基，然后再在另一氮原子上連入帶有一段碳連的羧基，即為百草枯半抗原，從而為百草枯完全抗原的合成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 4，4’-聯(lián)吡啶、碘甲烷、N，N二甲基甲酰胺（DMF）、濃 HCl、丙酮、體積分?jǐn)?shù) 95%乙醇等均為分析純，氮?dú)猓?A分子篩。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 Spectronic 1.70紫外可見光分光光度計(jì)，意大利GBC產(chǎn)品；WBG 1-4002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國產(chǎn)品；79-1型磁力加熱攪拌器，常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所提供；DF-101S型集熱式磁力攪拌器，江蘇省金壇市正基儀器有限公司制造；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，鞏義市站街光亞儀器廠制造；DZF-6020型真空干燥箱，鞏義市英峪予華儀器廠制造；SX2箱式電阻爐，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司制造；Waters Platform ZMD 4000型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司產(chǎn)品；BC-W201型恒溫浴鍋，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司制造；ALPHA1-4型冷凍干燥機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

百草枯的分子結(jié)構(gòu)式如圖1，本實(shí)驗(yàn)以4，4’-聯(lián)吡啶和碘甲烷為起始原料[4，9]，合成了N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物（簡稱PQ-h），用于制備百草枯的人工抗原。其合成路線如圖2，反應(yīng)分3步完成。

圖1 百草枯的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structural formula of paraquat

圖2 百草枯人工半抗原的合成路線Fig.2 Synthesis route of artificial hapten for paraquat

1.2.1 N-甲基-二吡啶陽離子化合物——Monoquat（MQ）的合成 事先將50 mL的三頸圓底燒瓶通氮?dú)馀懦渲械目諝?，稱取3 g 4，4’-聯(lián)吡啶于圓底燒瓶中，加入30 mL無水丙酮溶解后冷卻至4℃，在磁力攪拌下慢慢加入1.14 mL碘甲烷（CH3I），于暗處反應(yīng)。反應(yīng)混合物完全加入后，低溫（4℃左右）攪拌過夜。用無水丙酮洗滌，抽干，得產(chǎn)品MQ，真空干燥，得黃色針狀結(jié)晶，然后存放于真空干燥器中，取少量進(jìn)行鑒定。

1.2.2 N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的合成 稱取1.56 g第一步反應(yīng)得到的MQ于圓底燒瓶中，加入30 mL新鮮蒸餾的無水二甲基甲酰胺（DMF）溶解，然后加入1.6 mL 5-溴戊酸乙酯在120℃油浴磁力攪拌下反應(yīng)，回流5 h，然后室溫放置過夜。抽濾，用無水DMF洗滌，真空干燥，得黃色片狀結(jié)晶，存放于真空干燥器中，取少量進(jìn)行鑒定。

1.2.3 N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶陽離子化合物（PQ-h）的合成 稱取0.3 g第二步得到的N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物與23 mL濃HCl混合，水浴加熱回流3 h左右。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸去過量的酸和水，保持水浴溫度不超過60℃，蒸干，得固體殘留物。冷卻后，加入少量丙酮結(jié)晶（析出白色晶體），過濾，抽干，真空干燥，得粗品，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)95%乙醇重結(jié)晶，真空干燥，存放于真空干燥器中，取少量進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

取上述每一步合成的百草枯衍生物進(jìn)行LCMS鑒定和1HNMR鑒定，并將百草枯半抗原進(jìn)行IR鑒定，結(jié)果見圖3—9。

2.1 N-甲基-二吡啶陽離子化合物——Monoquat（MQ）的 LC-MS、1HNMR 鑒定

由圖3知，第一步反應(yīng)合成的產(chǎn)物純度較高，達(dá)95%以上，說明反應(yīng)比較徹底，基本無副產(chǎn)物生成。經(jīng)計(jì)算產(chǎn)物得率約為86%。由質(zhì)譜圖可看出產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為171，這與目標(biāo)產(chǎn)物——N-甲基-二吡啶陽離子化合物（MQ）的相對分子質(zhì)量一致。

圖3 N-甲基-二吡啶陽離子化合物（MQ）的LC圖譜和MS圖譜Fig.3 LC spectrum (A)and MS spectrum (B)of N-methyl-4-(pyridine-4-pyridyl)pyridinium(MQ)

由圖 4可知，該物質(zhì)的1HNMR （500 MHz，D2O）:δ為 8.92（d，2H，ArH），8.76（d，2H，ArH），8.39（d，2H，ArH），7.9 （d，2H，ArH），4.5 （s，3H，CH3），所得結(jié)構(gòu)信息與目標(biāo)物——N-甲基-二吡啶陽離子化合物（MQ）的結(jié)構(gòu)信息相同，從而推斷其為目標(biāo)產(chǎn)物[9]。

圖4 N-甲基-二吡啶陽離子化合物（MQ）的1HNMR圖譜Fig.4 1HNMR spectrum of N-methyl-4-(pyridine-4-pyridyl)pyridinium(MQ)

2.2 N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的LC-MS、1HNMR鑒定

圖5的LC圖出現(xiàn)兩個峰，N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物在液相色譜上的保留時(shí)間為1.62 min，其余為雜質(zhì)峰，通過積分計(jì)算其純度為70%。由質(zhì)譜圖可以看出，300.5為N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的陽離子峰，計(jì)算得其相對分子質(zhì)量為300，與實(shí)際相對分子質(zhì)量相符。

圖5 N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的LC圖譜和MS圖譜Fig.5 LC spectrum (A)and MS spectrum (B)of N-(5-ethoxy-5-oxopentyl)-N'-methylbipyridilium

由圖 6可知，該物質(zhì)的1HNMR （500 MHz，D2O）:δ（ppm）9.18 （d，2H，ArH），9.11 （d，2H，ArH），8.61（d，2H，ArH），8.58（d，2H，ArH），4.56（s，3H，NCH3），2.54 （t，2H，CH2），2.18 （t，2H，CH2），1.76（m，2H，CH2），1.29 （t，3H，CH3）， 所得結(jié)構(gòu)信息與目標(biāo)物——N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的結(jié)構(gòu)信息相同，從而推斷其為目標(biāo)產(chǎn)物[9]。

圖6 N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶陽離子化合物的1HNMR圖譜Fig.6 1HNMR spectrum of N-(5-ethoxy-5-oxopentyl)-N'-methylbipyridilium

2.3 N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶陽離子化合物（PQ-h）的 LC-MS、1HNMR 鑒定

由圖7可知，酸水解后的產(chǎn)物相對較純，純度達(dá)96%。由質(zhì)譜圖可看出272.5為PQ-h的陽離子峰，計(jì)算得其相對分子質(zhì)量為272，與實(shí)際的相對分子質(zhì)量相符，經(jīng)計(jì)算得率為69%。

圖7 N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶陽離子化合物（PQ-h）的LC圖譜和MS圖譜Fig.7 LC spectrum (A)and MS spectrum (B)of N-(5-ethoxy-5-oxopentyl)-N'-methylbipyridilium(PQ-h)

由圖 8可知， 該物質(zhì)的1HNMR （500 MHz，D2O）:δ為 9.18（d，2H，ArH），9.11（d，2H，ArH），8.61（d，2H，ArH），8.57 （d，2H，ArH），4.81 （t，2H，CH2），4.56 （s，3H，CH3），2.54 （t，2H，CH2），2.19 （m，2H，CH2），1.75 （m，2H，CH2）， 羧基上的活潑氫被溶劑DO2中的D替換。該所得結(jié)構(gòu)信息與目標(biāo)物——N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶陽離子化合物（PQ-h）的結(jié)構(gòu)信息相同，從而推斷其為目標(biāo)產(chǎn)物[9]。

2.4 IR鑒定結(jié)果及分析

取合成的百草枯半抗原進(jìn)行IR （KBr壓片）鑒定，結(jié)果見圖9。

圖8 N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶陽離子化合物 （PQ-h）的1HNMR圖譜Fig.8 1HNMR spectrum of N-(5-ethoxy-5-oxopentyl)-N'-methylbipyridilium(PQ-h)

圖9 百草枯半抗原的IR圖譜Fig.9 IR spectrum of paraquat hapten

由圖9知，3 439.32 cm-1對應(yīng)的寬的峰為羧酸上的O—H伸縮吸收，3 017.81 cm-1對應(yīng)的為芳環(huán)上C—H的伸縮振動，1 726.93 cm-1為C=O的吸收，1 638.41 cm-1為C=N的吸收（即吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)），1 397.79、1 447.97、1 508.61、1 559.84 cm-1均 為C=C骨架的振動，826.04 cm-1為芳環(huán)上C—H面外彎曲振動吸收。通過以上分析，初步確定為目標(biāo)產(chǎn)物—PQ-h。

3 結(jié)語

在農(nóng)藥殘留的免疫學(xué)分析中，人工抗原的合成是制備抗體和建立免疫分析方法最關(guān)鍵的步驟，而半抗原的設(shè)計(jì)又是合成人工抗原的前提。半抗原的設(shè)計(jì)要求應(yīng)盡量使合成的半抗原能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并且產(chǎn)生的抗體應(yīng)具有預(yù)期的活性[11]。因此，應(yīng)盡量保證半抗原分子具有與待測物分子類似的立體化學(xué)特征。一般將半抗原設(shè)計(jì)成包含一個間隔臂和偶聯(lián)基團(tuán)，并仍具有原農(nóng)藥分子基本結(jié)構(gòu)的分子。通常認(rèn)為連接臂的最適長度在3～6個碳原子，連接臂太短不利于半抗原的充分暴露，而連接臂太長又會因疏水作用而造成烷基鏈的折疊，導(dǎo)致半抗原分子仍然被載體蛋白質(zhì)所掩蓋，不利于抗原遞呈細(xì)胞（APC）的識別[12]。

在本研究中，采用百草枯的結(jié)構(gòu)類似物—4，4’-聯(lián)吡啶通氮?dú)獗Ｗo(hù)下經(jīng)3步化學(xué)反應(yīng)合成了目標(biāo)產(chǎn)物，并用ESI、1HNMR、IR對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。經(jīng)分析證明，合成的百草枯中間體純度較高，可以將其與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備百草枯人工抗原。

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