酪蛋白酶解物螯合鐵對(duì)大鼠的補(bǔ)鐵效果試驗(yàn)

孫 寧， 王志耕， 梅 林， 薛秀恒

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院，安徽 合肥 230036）

通過(guò)對(duì)鐵吸收機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，鐵主要通過(guò)十二指腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血液，參加血紅素、運(yùn)鐵蛋白質(zhì)等的合成。十二指腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜由蛋白質(zhì)和類脂組成，鐵離子需要一種載體分子與之形成具有脂溶性表面的螯合物才能穿過(guò)細(xì)胞膜。

酪蛋白經(jīng)酶水解可生成多種天然生理活性肽。其中含一類富含絲氨酰磷酸簇的活性短肽:酪蛋白磷酸肽（CPP）。有研究表明，一定條件下Fe2+可以與CPP螯合，形成一種可溶性絡(luò)合物——酪蛋白磷酸肽螯合鐵（Fe2+-CPP）。鐵與酪蛋白酶解物螯合后，能有效提高鐵在消化道尤其是小腸中的溶解性，而溶解率的高低與機(jī)體吸收鐵呈正比[1-2]。同時(shí)，酪蛋白酶解物螯合鐵可以抵御胃部低pH環(huán)境和酶引起的分解，保護(hù)鐵以穩(wěn)定狀態(tài)到達(dá)小腸上皮細(xì)胞[3-5]。

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室制備獲得的酪蛋白酶解物螯合鐵（Fe2+-Cas hydr）為材料，開(kāi)展缺鐵性貧血模型大鼠的動(dòng)物試驗(yàn)，探討Fe2+-Cas hydr的補(bǔ)鐵效應(yīng)劑量，并以甘氨酸螯合鐵（Fe2+-Gly）為對(duì)照，比較兩種有機(jī)物螯合鐵對(duì)缺鐵性貧血大鼠的治療效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 血清鐵（serum iron，SF）測(cè)定試劑盒、血清總鐵結(jié)合力（total iron binding capacity，TIBC）測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；脫脂乳粉，F(xiàn)onterra Ltd 生產(chǎn)；胰蛋白酶 250 U/g，Sigma公司生產(chǎn)；Sephadex G-15，Pharmacia公司生產(chǎn)。

1.1.2 設(shè)備 Sepctr AA 220型原子吸收分析儀，Varian公司制造；MC99-33型自動(dòng)液相色譜分離層析儀，上海青浦滬西儀器廠制造；FD-1CE冷凍干燥機(jī)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司制造；半自動(dòng)血常規(guī)分析儀，泰安市泰諾科貿(mào)醫(yī)療器械有限公司制造；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司制造。

1.1.3 動(dòng)物 普通級(jí) SD（Sprague Dawley）大鼠，雌性、健康、4周齡，體質(zhì)量75～86 g，安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.4 酪蛋白酶解物螯合鐵的制備 采用等電點(diǎn)沉淀法，以脫脂乳粉為原料制備酪蛋白。將所得酪蛋白與胰蛋白酶按一定比例混合，水解。水解產(chǎn)物在一定條件下以一定比例與FeCl2螯合。螯合物經(jīng)Sephadex G-15脫鹽，收集吸光度在220 nm吸收峰時(shí)的產(chǎn)物，冷凍干燥得Fe2+-Cas hydr（螯合物已經(jīng)紅外光譜分析證明）。

甘氨酸螯合鐵 （Ferrous glycinate，F(xiàn)e2+-Gly）:分子式 Fe（NH2CH2COO）2，食品級(jí) Fe2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥20.0%，F(xiàn)e3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤2.0%，河北東華化工集團(tuán)提供。

常規(guī)日糧和純合日糧:自配，配方及鐵含量（原子吸收法實(shí)測(cè)值）見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分Table 1 Composition and nutrient level of experimental diets

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型 健康SD大鼠65只。 飼養(yǎng)條件:溫度（23±2） ℃，相對(duì)濕度（50±10）%。預(yù)飼5 d后，隨機(jī)分為正常組10只，造模組50只。正常組飼喂常規(guī)日糧，飲去離子水；造模組飼喂低鐵純和日糧，飲去離子水。所有大鼠自由進(jìn)食，采用不銹鋼籠及塑料飲水罐，試驗(yàn)過(guò)程避免鐵污染。從第3周開(kāi)始，每10 d從造模組中隨機(jī)選取30只大鼠，尾靜脈采血測(cè)血紅蛋白（Hb）含量。當(dāng)隨機(jī)選取的大鼠Hb全部小于90 g/L時(shí)，取全部?jī)山M大鼠尾血，肝素抗凝，測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)，稱體質(zhì)量。詳見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。血液學(xué)指標(biāo)包括:血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、血清鐵（SF）、血清總鐵結(jié)合力（TIBC）和血清運(yùn)鐵蛋白飽和度（TS）。

1.2.2 補(bǔ)鐵試驗(yàn)大鼠分組情況 （1）常規(guī)日糧組（正常對(duì)照組）；（2）低鐵純和日糧組（貧血模型組）；（3）Fe2+-Gly 組 （陽(yáng)性對(duì)照組）*；（4）Fe2+-Cas hydr高劑量組（1.818 μg/（g.d））**；（5）Fe2+-Cas hydr中劑量組 （0.363 μg/（g.d））*；（6）Fe2+-Cas hydr 低 劑 量 組（0.073 μg/（g.d））。

注:*以鐵計(jì)。本組鐵劑量根據(jù)成年女性每天適宜攝入量（AI）作為參照系，C組劑量與E組劑量相同。**設(shè)高劑量組鐵含量為中劑量組的5倍。

1.2.3 補(bǔ)鐵試驗(yàn)操作過(guò)程 將造模組大鼠隨機(jī)分為（2）（3）（4）（5）（6）5 個(gè)組，每組 10 只，個(gè)體喂養(yǎng)。試驗(yàn)期間，（1）組（原正常組）繼續(xù)飼喂常規(guī)日糧，飲去離子水。（2）—（6）組繼續(xù)飼喂純和日糧，飲去離子水。（3）—（6）組每日定時(shí)供給定量去離子水的同時(shí)，向4組飲水中分別加入對(duì)應(yīng)劑量的Fe2+-Cas hydr和 Fe2+-Gly。 記錄（3）—（6）組大鼠每日消耗的日糧量和飲水量?；謴?fù)試驗(yàn)期間，每12 d采全部大鼠尾血測(cè)Hb濃度。第37天，稱全部大鼠體重，斷頸處死，采動(dòng)脈血，測(cè)血液學(xué)指標(biāo)。

1.2.4 Fe的生物利用率 （BioFe）的計(jì)算[7]根據(jù)Fe2+-Cas hydr各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組補(bǔ)鐵試驗(yàn)期每日消耗的飼料量、飲水量，計(jì)算（3）—（6）組每只大鼠的總鐵攝入量 （total iron intake in per animal，ToFeIn），再綜合補(bǔ)鐵試驗(yàn)前后（3）—（6）組大鼠的體質(zhì)量和Hb濃度，計(jì)算BioFe。詳見(jiàn)文獻(xiàn) [7]。利用Oliveira提出的公式計(jì)算BioFe:

注:① HbFef（the final hemoglobin iron）表示最終血紅蛋白含鐵量，mg；② HbFei（the initial hemoglobin iron）表示最初血紅蛋白含鐵量，mg；③ToFeIn（the total iron intake）表示總鐵攝入量（補(bǔ)鐵期每只大鼠從飼料和補(bǔ)鐵劑中攝入鐵的總量，mg）。*HbFe（HbFef and HbFei）的計(jì)算公式

上式中:mB為每只試驗(yàn)大鼠的體質(zhì)量，g；0.067為每克體質(zhì)量的血容量為0.067 mL，mL/g；Hb為每只大鼠血紅蛋白質(zhì)量濃度（最初血紅蛋白質(zhì)量濃度或最終血紅蛋白質(zhì)量濃度），g/L；3.4為每克血紅蛋白含鐵量為 3.4 mg，mg/g。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS軟件中的ANOVA法進(jìn)行方差分析和組間比較，試驗(yàn)結(jié)果以mean±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 缺鐵性貧血模型建立結(jié)果

見(jiàn)表2。

表2 建模后正常組與造模組結(jié)果比較Table 2 Comparison of iron-deficient rats with control group（mean±SD）

表2顯示，建模前后正常組與模型組體質(zhì)量無(wú)顯著差異 （P﹥0.05）。正常組血液學(xué)指標(biāo)的Hb、RBC、HCT、SF、TS 顯著高于模型組（P﹤0.05）。 模型組的TIBC顯著高于正常組（P﹤0.05）。模型組Hb、SF、TIBC、TS均達(dá)到貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)，Hb降到 （79.0±2.5）g/L，處于中度貧血狀態(tài)。

2.2 補(bǔ)鐵期間各組血紅蛋白的變化趨勢(shì)

圖1顯示，補(bǔ)鐵期間，常規(guī)組Hb保持在130 g/L左右；Fe2+-Cas hydr高劑量組Hb提升幅度最大，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)Hb恢復(fù)到與正常組一樣的水平；Fe2+-Cas hydr中劑量組與Fe-Gly組Hb變化趨勢(shì)基本一致，Hb恢復(fù)到120 g/L左右，提升幅度小于Fe2+-Cas hydr高劑量組；Fe2+-Cas hydr低劑量組試驗(yàn)初期 Hb基本無(wú)變化，最終僅提升到（94.3±2.8）g/L；模型組Hb處于繼續(xù)下降趨勢(shì)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)下降到（66.8±4.9） g/L，接近重度貧血。

2.3 補(bǔ)鐵試驗(yàn)后血液學(xué)指標(biāo)

根據(jù)表 3，（5）組與（3）組的 Hb、RBC、HCT 指標(biāo)無(wú)顯著差異（P＞0.05），而兩組的 SF、TIBC、TS 值存在顯著差異（P＜0.05 ）。 （4）組的 HCT、SF、TS 指標(biāo)均顯著高于其他組（P＜0.05 ），Hb、RBC 指標(biāo)與（1）組一致（P＞0.05），但高于其他試驗(yàn)組（P＜0.05 ），TIBC值與（1）組和（5）組一致（P＞0.05），但顯著低于（6）（3）（2）組（P＜0.05 ）。（5）組與（4）組相比，除 TIBC 差異不顯著（P＞0.05 ），其他指標(biāo)均與（4）組存在顯著差異（P＜0.05 ）。（6）組 Hb、RBC、HCT、SF、TS 值均顯著低于其他組，但顯著高于（2）組（P＜0.05 ）。

圖1 補(bǔ)鐵期間各組血紅蛋白含量變化Fig.1 Changes of hemoglobin in recovery test

表3 補(bǔ)鐵試驗(yàn)后各組血液學(xué)指標(biāo)比較Table 3 Haematological index for IDA cure（N=10，mean±SD）

2.4 鐵的生物利用率（BioFe）

結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)組鐵生物利用率Table 4 BioFe of the Studies Sources（N=10，mean±SD）

經(jīng)過(guò)36 d鐵補(bǔ)充試驗(yàn)，F(xiàn)e2+-Cas hydr中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組的BioFe值差異不顯著 （P＞0.05），但顯著高于高劑量和低劑量組 （P＜0.05）。Fe2+-Cas hydr高劑量組的BioFe值顯著低于Fe2+-Cas hydr低劑量組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 缺鐵性貧血模型建立分析

當(dāng)每日攝取的鐵量少于損失（應(yīng)補(bǔ)充）的鐵量，一段時(shí)間后，儲(chǔ)備鐵用完，血液中Hb含量和RBC會(huì)減少，出現(xiàn)不同程度的貧血癥狀，因此降低日糧中鐵含量建立缺鐵性貧血模型鼠的方法簡(jiǎn)單易行。同時(shí)，機(jī)體會(huì)對(duì)死去細(xì)胞和老舊紅細(xì)胞中釋放的鐵進(jìn)行再利用，該鐵與一種蛋白質(zhì)結(jié)合形成運(yùn)鐵蛋白，該蛋白質(zhì)具有緩沖作用，使短期內(nèi)缺鐵的情況不明顯。因此，建模歷程要在30 d以上，建模效果檢查可在30 d后開(kāi)始。

3.2 補(bǔ)鐵試驗(yàn)結(jié)果分析

研究發(fā)現(xiàn)，直接向牛乳中加入鐵鹽（如FeSO4），鐵離子在消化道中易受牛乳中鈣和蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)交互作用影響，使鐵產(chǎn)生聚合和不溶解。經(jīng)胰蛋白酶水解的酪蛋白酶解物與Fe2+螯合后可以保護(hù)Fe2+，避免受其他營(yíng)養(yǎng)物負(fù)面交互作用的影響[9-10]。

現(xiàn)有試驗(yàn)研究結(jié)論認(rèn)為，動(dòng)物體內(nèi)鐵的營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)其吸收鐵的能力有顯著影響，體內(nèi)鐵貯低時(shí)，受試動(dòng)物對(duì)鐵吸收能力增強(qiáng)，相反則吸收能力減弱[11-12]。但本次試驗(yàn)并未取得一致結(jié)論，本次試驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物對(duì)飼料中鐵的吸收利用可能存在更復(fù)雜的調(diào)控機(jī)理。如本試驗(yàn)中，雖然高劑量組治愈貧血大鼠的貧血癥狀效應(yīng)最好，但其BioFe值低于其他各試驗(yàn)組。同時(shí)，低劑量組的BioFe值（28.95%）僅優(yōu)于高劑量組的 （24.20%），卻遠(yuǎn)低于中等劑量組的（40.55%），這有待進(jìn)一步研究證明。

氨基酸作為鐵離子的載體，可以增加鐵的溶解性，提高鐵在腸腔內(nèi)的溶解度，促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞對(duì)鐵的吸收[13-15]。根據(jù)本試驗(yàn)中甘氨酸鐵和等劑量酪蛋白酶解物螯合鐵試驗(yàn)組基本一致的補(bǔ)鐵效應(yīng)結(jié)果，可推測(cè)，氨基酸可能與酪蛋白酶解物具有基本相同的促鐵吸收機(jī)理。飲食中的鐵被十二指腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液后，與一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成運(yùn)鐵蛋白質(zhì)，與運(yùn)鐵蛋白質(zhì)結(jié)合的鐵即為血清鐵（SF）。未被吸收的外源鐵則隨尿液和糞便排出體外。本試驗(yàn)中，等鐵劑量的Fe2+-Cas hydr組的SF、TS（血清運(yùn)鐵蛋白飽和度）值顯著高于Fe2+-Gly組，表明，酪蛋白酶解物促進(jìn)小腸吸收鐵的能力強(qiáng)于甘氨酸。但兩組的RBC、Hb、HCT和BioFe值差異不顯著，分析原因可能是由于動(dòng)物紅細(xì)胞周期性更新和死亡所釋放出的鐵，部分可作為機(jī)體造血原料再利用所致。

有研究表明，酪蛋白經(jīng)胰蛋白酶解后，除生成CPP外還產(chǎn)生具有其他功能的非磷酸肽。這些非磷酸肽會(huì)負(fù)面影響鐵的溶解性，從而影響機(jī)體對(duì)鐵的吸收，因此純酪蛋白磷酸肽螯合鐵的補(bǔ)鐵效果應(yīng)優(yōu)于酪蛋白水解物螯合鐵[16-18]。據(jù)此可預(yù)測(cè)，F(xiàn)e2+-Cas hydr經(jīng)過(guò)純化后所獲得的純Fe2+-CPP在相同的鐵計(jì)量下，效果可能更優(yōu)于Fe2+-Gly，這有待試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)語(yǔ)

Fe2+-Cas hydr 在 鐵 計(jì) 量 為 1.818 μg/（g.d） 與0.363 μg/（g.d）之間有良好的貧血治療作用。相同鐵計(jì)量的Fe2+-Cas hydr與Fe2+-Gly具有同等補(bǔ)鐵效果。Fe2+-Cas hydr在鐵計(jì)量為 0.073 μg/（g.d）水平下無(wú)法改善貧血癥狀。

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