桃果實總蛋白質(zhì)雙向電泳優(yōu)化體系的建立

張 麗， 姜 麗， 石 韻， 康若祎， 王利斌， 郁志芳*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 蘇州 215155；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，江蘇 南京 210095）

基因組學(xué)提供了細(xì)胞中大量或全部基因表達的快速檢測，但是mRNA水平并不一定能預(yù)測細(xì)胞中相對蛋白質(zhì)表達[1]。在蛋白質(zhì)的表達過程中，各種mRNA不同的穩(wěn)定性和不同的翻譯效率都會影響蛋白質(zhì)的表達。蛋白質(zhì)形成后，許多參與信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期控制的蛋白質(zhì)會迅速轉(zhuǎn)換，而且蛋白質(zhì)在內(nèi)源翻譯后也會因環(huán)境因素而改變[2-3]。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究變得尤為重要。

如今，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于動物和微生物領(lǐng)域的研究，在植物生物學(xué)方面也有廣泛的應(yīng)用[4]。而由于水果中蛋白質(zhì)含量相對較低，并且含有大量干擾性物質(zhì)，如色素、淀粉、多酚、多聚糖、單寧和有機酸類等，從果實組織中提取蛋白質(zhì)更加困難[5-6]。因此，果實蛋白質(zhì)組學(xué)具有很大的難度。

目前桃的采后保鮮研究大多數(shù)都集中在應(yīng)用方面，對于深入的機理研究還不透徹，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究也較少[7-8]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，作者希望運用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法和手段研究桃果實在成熟衰老過程中特異性蛋白質(zhì)的表達，進而更深入地探討桃果實的成熟衰老的機理。但是目前桃果實蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)不是很成熟，包括桃果實蛋白質(zhì)的提取方法、雙向電泳技術(shù)都需要改進和優(yōu)化，本研究的目的是探索和掌握桃果實總蛋白質(zhì)雙向電泳的方法，為后續(xù)的研究提供更好的技術(shù)平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘暉雨露’桃果實，采自江蘇農(nóng)科院桃園。取成熟期果實若干，去皮后，用水果刀取適量果肉，在液氮中速凍后保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

固化IPG線性干膠條 pH 3～10和pH 4～7、兩性電解質(zhì)，購自美國Bio-Rad公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、甘氨酸、CHAPS、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、牛血清蛋白（BSA）、EGTA、苯甲基磺酰氟（ PMSF ）、考馬斯亮藍G-250、溴酚藍、低熔點瓊脂糖、十二烷基磺酸鈉（SDS）、硫脲，購自 Amerisco公司；三氯乙酸（TCA）、蔗糖等其他所用藥品或試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.3 儀器與設(shè)備

高速離心機，美國 Thermo電子公司制造；UV/VIS 2802PC分光光度計，中國上海尤尼柯公司制造；Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)，美國GE Healthcare公司制造；Protean IEF System水平電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司制造；Versdoc 3000凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司制造；PDQuest 7.2.1分析軟件，美國Bio-Rad公司研發(fā)。

1.4 方法

1.4.1 蛋白質(zhì)提取方法

1）TCA-丙酮法[3]:稱取6 g果肉，用液氮在研缽中將其研磨成粉。然后入5倍體積-20℃預(yù)冷的10 g/dL TCA（含0.07%體積分?jǐn)?shù)的β-巰基乙醇），勻漿液于-20℃下過夜培養(yǎng)。20 000×g離心30 min，收集沉淀。沉淀用冷丙酮沖洗3次，并在4℃下干燥，之后溶于裂解緩沖液中，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2）勻漿法:參照Chan等的方法[4]并稍加改進。稱取6 g果肉，用液氮在研缽中研磨成粉。加入3 mL的勻漿緩沖液，勻漿液中含有20 mmol/L的Tris-HCl （pH 8.0），250 mmol/L 的蔗糖，10 mmol/L的 EGTA，1 mmol/L 的 PMSF，1 mmol/L 的 DTT，以及1%體積分?jǐn)?shù)的Triton X-100，繼續(xù)研磨。勻漿液以20 000×g離心30 min。將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入終質(zhì)量濃度為10 g/dL的TCA溶液，-20℃下放置 2 h，20 000×g離心 30 min，收集沉淀。 用冷丙酮沖洗3次，4℃下干燥后溶于裂解緩沖液中，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

3）酚抽法:根據(jù)Zhang等[5]的方法。稱取5 g果肉，用液氮在研缽中研磨成粉。然后加入5 mL的勻漿緩沖液，勻漿液中含有60 mmol/L Tris，1.05 mol/L的蔗糖，10 mmol/L 的 EGTA，1 mmol/L 的 PMSF，1 mmol/L的DTT以及1%體積分?jǐn)?shù)Triton X-100，pH為8.35，繼續(xù)研磨。勻漿液以20 000×g離心30 min。上清液中加入三倍體積的pH為7.8的Tris-飽和酚，充分搖蕩，混勻，10 000×g，4 ℃下離心 30 min，上層為酚相，中間白色物質(zhì)為雜質(zhì)，下層為水相。回收酚相，加入5倍體積預(yù)冷丙酮，充分混勻，-20℃下過夜培養(yǎng)，沉淀蛋白。沉淀分別用預(yù)冷的甲醇和丙酮沖洗2次，4℃下干燥后溶于裂解緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 蛋白質(zhì)的溶解 每毫克蛋白質(zhì)干粉加入10 μL的蛋白質(zhì)裂解緩沖液 （7 mol/L的尿素，2 mol/L的硫脲，4%體積分?jǐn)?shù)的兩性離子去污劑CHAPS，1 g/dL的二硫蘇糖醇 （DTT）和0.5%體積分?jǐn)?shù)的pH 4～7 IPG buffer）溶解。 4℃溶解過夜后，4℃條件下5 000×g離心10 min后，取上清液即為蛋白質(zhì)樣品溶液，100 μL的離心管分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 蛋白質(zhì)含量的測定 蛋白質(zhì)含量的測定采用Bradford方法[6]，但略作修改。染色劑為Bradford工作液:考馬斯亮藍G-250溶于5 mL的95%體積分?jǐn)?shù)的乙醇中，與10 mL 85%體積分?jǐn)?shù)的磷酸混合定溶到100 mL，配好后用普通濾紙過濾，4℃ 避光保存。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:1 mg/mL牛血清白蛋白，-20℃分裝在1 mL的離心管中，每次定量取出一管。實驗操作:取9只大于10 mL的試管，每管加入3 mL染色劑，在1—6管中分別加入0～80 μL不等的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，另外3個管子分別加入10 μL的待測樣品。測定每管的溶液在595 nm下的吸光值，根據(jù)前6管的吸收值和濃度的關(guān)系繪制蛋白質(zhì)含量與相應(yīng)吸收值的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2＞0.999）。

1.5 雙向電泳

1.5.1 等電聚焦 在IPG膠條槽中加入350 μL溶有樣品的IPG膠條溶脹液后，將17 cm pH分別為3～10和4～7的IPG膠條膠面向下放入槽內(nèi)，膠面與溶脹液間不要產(chǎn)生氣泡，蓋上膠條槽的蓋子，放于IPG等電聚焦儀上，以50 V低電壓泡脹12 h后進行等電聚焦（IEF），溶脹1 h后每根膠條滴加3 mL礦物油。50 V主動水化后，等電聚焦的參數(shù)參照Zhang等[5]的方法（表1），每根膠條最大電流設(shè)置50 μA，溫度設(shè)置20℃。

表1 桃果實蛋白質(zhì)17 cm膠條等電聚焦程序設(shè)置Table 1 Program of isoelectric focusing of total protein of peach fruit with 17 cm IPG strip

1.5.2 IPG膠條的平衡 取出含樣品的膠條先后置于5 mL膠條平衡緩沖液Ⅰ（6 mol/L的尿素、4 g/dL的 SDS、50 mmol/L 的 Tris-HCl （pH 8.8），20%體積分?jǐn)?shù)的甘油、2 g/dL的DTT）和5 mL膠條平衡緩沖液Ⅱ （6 mol/L的尿素、4 g/dL的 SDS、50 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.8），20%體積分?jǐn)?shù)的甘油、2.5 g/dL 的碘乙酰胺）中各平衡20 min，用去離子水沖洗干凈。

1.5.3 第二向SDS-PAGE 垂直板電泳采用Ettan DALT six垂直電泳系統(tǒng)，膠質(zhì)量濃度為12 g/dL，電泳方式為恒功率，16℃冷水循環(huán)，每根膠條5 W進行90 min，然后每根膠條15 W運行6 h，直至溴酚藍前沿距離玻璃板下緣1 cm時停止電泳。

1.5.4 染色 分別采用改良膠體考馬斯亮藍G-250染色法和銀染法對蛋白質(zhì)進行染色。

改良膠體考馬斯亮藍染色法:凝膠先經(jīng)超純水漂洗3次，每次1 min，再用膠體考馬斯亮藍G-250染色液 （0.12 g/dL的考馬斯亮藍G-250、10%體積分?jǐn)?shù)的磷酸，10 g/dL的硫酸銨，20%體積分?jǐn)?shù)的甲醇）染色1 h，然后用超純水洗滌至背景清晰。膠體考染液的配置:200 mL蒸餾水與118 mL 85%體積分?jǐn)?shù)的磷酸混勻，加入100 g硫酸銨攪拌溶解，另取一燒杯加入200 mL甲醇，加入1.2 g G-250攪拌溶解，然后將其緩慢加入上述硫酸銨溶液，并不斷攪拌，定容至1 000 mL，置于棕色試劑瓶室溫保存。

銀染法:參考馬洪雨等[7]的方法進行。

1.6 圖像采集與分析

采用Verser-doc 3000型凝膠成像系統(tǒng)對雙向凝膠電泳圖譜進行掃描，并用PDQuest-7.1.2分析軟件進行圖像分析處理[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白質(zhì)的提取方法對桃果實電泳圖譜的影響

本次實驗中比較了3種不同的蛋白質(zhì)提取方法對桃果實雙向電泳圖譜的影響，見圖1。結(jié)果表明，在相同條件下進行雙向電泳，用TCA/丙酮法和勻漿法提取蛋白質(zhì)，得到的圖譜不清晰，蛋白點很少，而且橫紋較多。在第一向的聚焦過程中，電流一直超過限定的最大電流50 μA，導(dǎo)致電壓很難上去，所以聚焦效果不好，分析原因可能是因為這兩種方法均使用TCA沉淀蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的離子強度較高，而且糖類、酚類或者脂類等雜質(zhì)沒有完全除去，且提取的蛋白質(zhì)較難溶解，這樣就影響了蛋白質(zhì)的聚焦。而利用酚抽法得到的蛋白點相對較多，且橫紋較少，點的分布相對均勻，比較清晰，同時在試驗過程中電流強度也較小，程序升壓很正常，這說明用酚抽法提取的蛋白離子強度低，蛋白質(zhì)純度較高，質(zhì)量較好，無背景干擾，圖譜較清晰。最終結(jié)果也證實了利用酚抽法確實能得到較好的電泳圖譜，條帶清晰，而且分離的效果最好。因此，綜合考慮，確定了后期實驗采用酚抽法來提取蛋白質(zhì)。

圖1 桃果實經(jīng)3種不同蛋白提取方法后的雙向電泳圖Fig.1 Comparison of 2-DE maps of peach fruit with different protein extraction methods

2.2 不同pH范圍膠條對桃果實2-DE圖譜的影響

為了更深入了解桃果實2-DE蛋白質(zhì)圖譜，使用不同pH范圍的IPG膠條進行實驗。分別采用pH 3～10和pH 4～7長為17 cm的IPG膠條來顯示桃果實蛋白質(zhì)在2-DE圖譜上的整體分布情況，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 兩種pH范圍的IPG膠條對桃果實2-DE圖譜的影響Fig.2 Comparison of 2-DE maps of peach fruit with two IPG strips with different gradients

由圖可知，在相同條件下雙向電泳，兩張圖均有較好的圖譜，但是pH3～10圖譜的蛋白點均集中在pH 4～8的范圍內(nèi)，使得膠條沒有得到很好的利用，而且蛋白點出現(xiàn)了堆積，蛋白質(zhì)沒有很好的分離，而pH 4～7的圖譜點分散得比較開，分布比較均勻，但在堿性端出現(xiàn)了一條縱條紋，這是因為膠條pH范圍的限制，使得pI等電壓大于7的蛋白質(zhì)被壓縮，這個垂直的條紋包括了所有等電點大于7的蛋白質(zhì)[8]。王一鳴[3]分析桃果實硬核期的蛋白質(zhì)選用了pH 5～8的膠條，可能是為了避免堿性端蛋白質(zhì)的堆積。王清等[9]分析桃果實蛋白質(zhì)組學(xué)選用pH 4～7的膠條，國外研究水果的蛋白質(zhì)組學(xué)文獻中，很多也是選用了 pH 4～7 的膠條[3，7，11-13]。 因此，綜合前人的經(jīng)驗、本實驗中蛋白點的分布情況，以及圖譜的清晰度，確定在以后的實驗中選擇pH 4～7的膠條進行雙向電泳。

2.3 不同染色方法對桃果實蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響

試驗中采用兩種經(jīng)典的染色方法，即膠體考染和銀染。由圖3可以看出，與膠體考染相比，銀染的靈敏度高，而且與背景的反差大，容易識別。但是銀染法的靈敏度較高，操作卻比較繁瑣，而且銀染過程中使用的醛類物質(zhì)會對蛋白質(zhì)起修飾作用，影響質(zhì)譜鑒定。本試驗中有足夠的蛋白質(zhì)上樣量，故用考馬斯亮藍膠體考染分別對兩張同樣條件下跑的膠進行染色。由圖可見，銀染雖然能提高蛋白質(zhì)著色的靈敏度，但只要有足夠的蛋白質(zhì)上樣量，膠體考染也可以達到同樣的效果。

圖3 不同染色方法對桃果實蛋白雙向電泳圖譜的影響Fig.3 Comparison of 2-DE maps of peach fruit with different staining protocols

當(dāng)然，電泳圖譜的染色方法還有很多，如銅染、鋅染和熒光染色等等，雖然其靈敏度都很高，但是由于成本較高，應(yīng)用不是很廣，因此作者采用膠體考染作為實驗的染色方法。

2.4 不同上樣量對桃蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的影響

蛋白質(zhì)的上樣量也直接影響著電泳圖譜的好壞，合適的蛋白質(zhì)上樣量才能跑出蛋白點清晰并且分布均勻的2-DE圖譜，故確定蛋白質(zhì)上樣量也是雙向電泳的一個關(guān)鍵步驟[10]。由圖4可見，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)上樣量達到1.0 mg時，呈現(xiàn)出的蛋白點較多，但由于蛋白質(zhì)濃度過高，影響了蛋白質(zhì)的聚焦，一些蛋白點堆積在一起，分離效果不是太好，這樣很難判斷差異點的表達量變化，給結(jié)果分析帶來不利影響。而800 μg上樣量的圖譜，膠上的蛋白點分布均勻，且低豐度蛋白質(zhì)能呈現(xiàn)，蛋白點間邊界清晰，無擴散和拖尾現(xiàn)象。故本實驗確定的桃果實蛋白質(zhì)的最佳上樣量是 800 μg。

圖4 不同上樣量對桃蛋白雙向電泳圖譜的影響Fig.4 Comparison of 2-DE maps of peach fruit with different loaded proteins

2.5 桃果實總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜重復(fù)性的討論

雙向電泳的試驗需要做3個以上的生物重復(fù)以減少試驗操作對電泳圖譜重復(fù)性的影響，本試驗中以上述建立的方法，利用酚抽法提取蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)上樣量為800 μg，采用 pH 4～7的IPG膠條、考馬斯亮藍G-250膠體考染，比較了桃果實總蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜的重復(fù)性。由圖5可以看出，3個重復(fù)樣品的電泳圖譜具有很清晰的分辨率，蛋白質(zhì)分離效果較好。利用PDQuest軟件 （美國伯樂公司）分析，蛋白斑點的匹配率可以達到90%以上，證明了利用本試驗建立的方法不僅可以得到高質(zhì)量的雙向電泳圖譜，同時具有較好的重復(fù)性。

圖5 桃果實總蛋白雙向電泳圖譜的重復(fù)性Fig.5 Repeatability of the 2-DE maps with the total proteins separated from peach fruit

3 討論

雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用為果實采后生物學(xué)的深入研究開創(chuàng)了新的篇章，但是雙向電泳技術(shù)步驟繁多，操作過程復(fù)雜，所以在操作過程中會出現(xiàn)各種各樣的問題，所以不同的樣品需要進行雙向電泳方法的建立，并不斷摸索和優(yōu)化。

3.1 樣品的提取方法

目前，植物材料的蛋白質(zhì)提取方法有很多，但是最常用的是3種:TCA/丙酮法，勻漿法，酚抽法。王清等[9]分別研究了利用這3種方法對不同的水果果實（甜櫻桃，桃子，蘋果，芒果）進行蛋白質(zhì)提取，結(jié)果證明，對于不同的水果而言，3種方法各有利弊:TCA/丙酮法對于4種果實得到的圖譜都不太理想，而勻漿法對桃子、蘋果、芒果提取蛋白質(zhì)可以得到清晰的雙向電泳圖譜，相對而言酚抽法對于不同的果實均能得到較好的圖譜。王一鳴[3]利用TCA/丙酮法提取桃果實全蛋白質(zhì)也得到了較好的圖譜。王卓[11]利用酚抽法和TCA/丙酮法提取香蕉果實總蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，TCA/丙酮法提取能夠得到較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，但是利用酚抽法得到的電泳圖譜最清晰，這與王清的研究結(jié)果一致。劉浩等[12]利用TCA/丙酮法提取龍眼幼果胚胎也得到了較好的圖譜。在國外的研究報道中，果實蛋白質(zhì)的提取方法主要以酚抽法為主[13]，不同果實最適的蛋白質(zhì)提取方法各不相同，而蛋白質(zhì)的提取方法以及提取蛋白質(zhì)的純度和質(zhì)量對于整個雙向電泳過程來說具有相當(dāng)重要的意義。所以，需要具體的試驗來摸索和確定各種果實的最佳的蛋白質(zhì)提取方法。

3.2 不同裂解液對樣品的溶解

不同的裂解液溶解蛋白質(zhì)對雙向電泳的影響也是很大的[14]。在雙向電泳的過程中，為了使蛋白質(zhì)得到最大程度的溶解，必須加入一些促溶劑、去污劑、還原劑和兩性電解質(zhì)等破壞蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，把蛋白質(zhì)解聚和變性成單體，使得蛋白質(zhì)在整個分離過程中以多肽鏈的形式存在，這樣得到的樣品不僅純度高，而且離子去除得比較徹底，如果樣品沒有得到很好的較穩(wěn)定地溶解，會造成蛋白質(zhì)的缺失或者蛋白質(zhì)點的不完全聚焦和一些水平條紋[15]。尿素是最常用的離液劑，主要作用是改變或者破壞氫鍵等次級鍵的結(jié)構(gòu)，使得蛋白質(zhì)變性并使蛋白酶失活[16]。硫脲不易溶于水，但溶于高濃度的尿素溶液中，通常情況下，尿素和硫脲一起使用，可以促進蛋白質(zhì)的溶解，尤其是膜蛋白質(zhì)的溶解。這兩者可以有效的破壞蛋白質(zhì)的疏水鍵，防止聚集作用和二級結(jié)構(gòu)的形成。另外，含有尿素的溶液應(yīng)在10～37℃的溫度范圍內(nèi)操作，低于10℃，尿素會析出；而高于37℃，尿素中的氰酸鹽會引起蛋白質(zhì)的甲?；痆17]。

DTT或者β-巰基乙醇是常用的還原劑。它們的主要作用是用于蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，增加蛋白質(zhì)的溶解性[18]。由于β-巰基乙醇?xì)馕斗浅Ｖ?，通常選用DTT作為還原劑。此外需要注意的是，DTT在室溫的半衰期很短，因此在操作過程中需要現(xiàn)用現(xiàn)加，而且一定要保存在-20℃。還有一種新型的還原劑TBP，它可以在很低的濃度下將蛋白質(zhì)還原，使用的效果比DTT還要好，能大大地增加蛋白質(zhì)的溶解性[19]。Triton X-100和NP-40是常用的非離子去污劑，CHAPS是兼性離子去污劑。它們的主要作用是破壞蛋白質(zhì)分子之間的疏水作用，提高蛋白質(zhì)的溶解性。還有一種新型的兼性離子去污劑ASB-14，也能增加蛋白質(zhì)的溶解性[12]。

除此之外，在裂解液中還經(jīng)常加入一些蛋白酶抑制劑，最常用的是PMSF，它不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶，它的毒性相當(dāng)大，因此要做好防護措施[20]。另外，它在水溶液中很快失活，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，它在含有巰基試劑（DTT或者β-巰基乙醇）時效果不好。還有一種蛋白酶抑制劑是AEBSF，它是一種絲氨酸水解酶的抑制劑，易溶于水而且毒性小，但是它具有修飾能力，會改變蛋白質(zhì)的等電點。有時候，也在裂解液中加入一些金屬離子螯合劑如EDTA或者EGTA，它們是通過螯合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來抑制金屬蛋白酶[21]。

因此，要對裂解液進行優(yōu)化，本實驗中采用的裂解液為裂解液I（7 mol/L的尿素，2 mol/L的硫脲，4 g/dL的CHAPS，65 mmol/L的 DTT，0.5%體積分?jǐn)?shù)的IPG Buffer），也采用裂解液Ⅱ（9 mol/L的尿素，4 g/dL 的 CHAPS，65 mmol/L 的 DTT，0.5%體積分?jǐn)?shù)的IPG Buffer。比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，裂解液I的使用得到的雙向電泳圖譜背景清晰，而且蛋白點多（未公開數(shù)據(jù)）。分析原因是裂解液I中加入了硫脲，兩者的結(jié)合使用使得蛋白質(zhì)的溶解性增加。

3.3 等電聚焦和IPG膠條的選擇

IEF是蛋白質(zhì)在pH梯度膠條中根據(jù)等電點的不同而進行分離。等電聚焦的參數(shù)和IPG膠條的選擇直接影響著雙向電泳圖譜的質(zhì)量。如果聚焦參數(shù)設(shè)置不當(dāng)，會導(dǎo)致聚焦時電壓上不去從而導(dǎo)致聚焦不完全，或者導(dǎo)致過度聚焦，使得電泳圖譜出現(xiàn)水平條紋或者垂直條紋，蛋白質(zhì)拖尾，有時會出現(xiàn)模糊不清的情況。因此，需要對等電聚焦的運行參數(shù)進行試驗和摸索[22]。

一般情況下，剛開始都是屬于除鹽的過程，都選擇較低的電壓，而且要緩慢上升，這樣不僅能使樣品充分地進入凝膠，而且能夠去除樣品中的鹽離子和其他的雜質(zhì)，達到充分除鹽的目的。這個低電壓的選擇根據(jù)不同的樣品而定。在除鹽結(jié)束后，就是升壓過程，這個一般選擇線性升壓，如果樣品很純的話，這個升壓過程會很順利，但是經(jīng)常會遇到電壓上不去的情況，這就要根據(jù)試驗的步驟來分析原因，可以調(diào)整升壓的程序，或者在水化結(jié)束后在膠條的兩極搭上鹽橋，或者改用杯上樣的方式，來去除鹽離子和雜質(zhì)的干擾。最后聚焦過程也要合適，聚焦太短，樣品不能很好的分離，會出現(xiàn)橫紋，降低分辨率，而聚焦時間太長的話，會造成過度聚焦，也造成橫紋的出現(xiàn)，甚至是蛋白質(zhì)的丟失。

試驗中使用不同pH范圍的IPG膠條得到了不同的雙向電泳圖譜，因此要根據(jù)不同的情況選擇不同的p H范圍的IPG膠條。窄pH范圍的IPG膠條有利于提高蛋白質(zhì)的分辨率。由本實驗可以看出，桃果實的蛋白質(zhì)主要分布在pH 4～7之間，因此實驗中采用pH 4～7的IPG膠條。

3.4 平衡液的成分及平衡時間

等電聚焦之后，影響雙向電泳的就是平衡，如果平衡不好，可能會在圖譜上產(chǎn)生條紋，影響圖譜的質(zhì)量。在本實驗中，將平衡液中的SDS的量由2 g/dL改為4 g/dL，而且延長了平衡的時間，由原來的15 min改為20 min，將DTT的使用量增加到200 mg/10 mL，這樣使得等電聚焦的蛋白質(zhì)得到了充分的平衡，從而得到了質(zhì)量較高的雙向電泳圖譜。在國外的文獻報道中，選用TBP來代替DTT，增加了等電聚焦中的溶解性，也增加了蛋白質(zhì)從第一向向第二向轉(zhuǎn)移的效率。TBP不帶電荷，在第二向電泳過程中不遷移，使得電泳圖譜的背景較淺，蛋白質(zhì)的分離效果好。

3.5 圖譜上的水平橫紋和垂直橫紋

在雙向電泳的過程中，常常會在圖譜上產(chǎn)生水平條紋，垂直條紋，或者是橫豎交叉的條紋，這些條紋出現(xiàn)的原因很多，現(xiàn)結(jié)合前人經(jīng)驗和自己試驗過程中的所得做一討論和分析。

一般情況下，水平條紋的產(chǎn)生有以下幾種原因:一是蛋白質(zhì)沒有充分提純，蛋白質(zhì)中含有大量的雜質(zhì)和鹽離子，因此要在樣品制備這一過程中做好文章；二是上樣量太大，會影響等電聚焦，尤其是在高相對分子質(zhì)量的區(qū)域蛋白質(zhì)展現(xiàn)不好，因此在蛋白質(zhì)定量的時候應(yīng)特別精準(zhǔn)；三是聚焦不充分，如果橫條紋主要集中在高分子區(qū)域的話，就要延長聚焦的時間，如果是整個膠上都是橫條紋的話，就要大量的延長第一向的運行時間，而不僅僅是聚焦時間；四是由于過度聚焦，這些蛋白質(zhì)主要存在于靠近電極的地方（是因為電內(nèi)滲現(xiàn)象干擾導(dǎo)致），由于過度聚焦導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，所以這些條紋存在于降解蛋白質(zhì)的一側(cè)，因此要適當(dāng)縮短聚焦時間。

雙向電泳圖譜上產(chǎn)生垂直條紋，主要是因為平衡和SDS-PAGE過程中的操作不當(dāng)造成的。一是平衡過程中，DTT的含量不夠或者平衡時間不夠，就會在二向上造成垂直拖尾；二是在加入烷基化平衡液之前，一定要瀝干DTT平衡液，不然會大大減低效力；第三，這兩個過程中的藥品出現(xiàn)問題或者過期，會造成垂直條紋的產(chǎn)生[23]。如果圖譜上出現(xiàn)了橫豎交叉的條紋，可能是覆蓋IPG膠條的瓊脂糖或者平衡液中存在雜質(zhì)，需要用新鮮配制的試劑，平衡過程中的DTT和碘乙酰胺也一定要現(xiàn)用現(xiàn)配和充分溶解。

除了水平和垂直條紋，在雙向電泳圖譜上還會出現(xiàn)一些圖像彎曲變形，主要是因為SDS-PAGE的膠沒有配均勻或者膠面沒有壓平導(dǎo)致。因此，在平衡轉(zhuǎn)移和SDS-PAGE的時候，一定要克服各種操作問題，從而得到分離效果很好的雙向電泳圖譜，提高蛋白質(zhì)分離的效率。

4 結(jié)語

通過上述試驗，最后確定采用酚抽法作為實驗中桃果實蛋白質(zhì)的提取方法，蛋白質(zhì)上樣量為800 μg，試驗確定采用 pH 4～7的IPG膠條，采用考馬斯亮藍G-250膠體考染為實驗中采用的染色方法。本研究成果為以后桃果實的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了有力的技術(shù)支持。

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