不同宿主來源的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶分離純化及化學(xué)修飾提高其熱穩(wěn)定性

吳 丹， 鄭賢良， 吳 敬

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122）

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶或稱環(huán)狀淀粉轉(zhuǎn)移酶（Cyclodextrin Glycosyltransferas， 簡 稱 CGT 酶 ，EC2.4.1.19）是α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成員，CGT酶是一種復(fù)合型的多功能酶，能催化4種不同的反應(yīng):環(huán)化反應(yīng)、偶合反應(yīng)和歧化反應(yīng)3種轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)以及水解反應(yīng)[1]。環(huán)化反應(yīng)是CGT酶所催化的特征性反應(yīng)，是將從底物中酶解下來的低聚糖鏈自身首尾相連形成環(huán)糊精，環(huán)化反應(yīng)是其工業(yè)應(yīng)用的基礎(chǔ)[2]。

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶通過環(huán)化反應(yīng)將D-吡喃型葡萄糖單元以α-1，4-糖苷鍵連接而形成[2]。目前工業(yè)應(yīng)用中最常見的環(huán)糊精為由6、7、8個葡萄糖單元構(gòu)成的α-、β-、γ-環(huán)糊精。由于環(huán)糊精具有表面分布著眾多反應(yīng)性羥基的外部親水結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有一個內(nèi)部疏水性很強(qiáng)的疏水內(nèi)腔，使其具有與表面活性劑相似的性質(zhì)，在與許多種客體物質(zhì)通過分子間相互可起到乳化劑的作用，形成主-客體包合物，比如無機(jī)分子、有機(jī)分子、絡(luò)合物甚至惰性氣體等，從而對客體物質(zhì)具有活性保護(hù)、控制緩釋、包埋等功能；同時(shí)，利用環(huán)糊精空腔與客體分子大小的匹配性，也可以用于多種異構(gòu)體分子的識別，制備大分子層析材料等。目前環(huán)糊精已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)和分析化學(xué)等領(lǐng)域[3-4]。

在環(huán)糊精的酶法合成中，酶與底物的反應(yīng)溫度一般是50～60℃，這就要求酶在50℃左右仍具有良好的穩(wěn)定性。關(guān)于CGT酶熱穩(wěn)定性研究方面，國內(nèi)西北大學(xué)郭燕等[5]通過海藻酸鈉固定化CGT酶，對其穩(wěn)定性進(jìn)行了系統(tǒng)分析；田暉等通過在殼聚糖上對CGT酶進(jìn)行固定化，使其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性均有所提高[6]。自20世紀(jì)70年代末以來，有關(guān)用有機(jī)物進(jìn)行蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的研究報(bào)道越來越多，化學(xué)修飾法也日益成為提高酶的穩(wěn)定性的重要手段[7-8]。通過化學(xué)試劑特異性修飾酶分子的某個或某類氨基酸，可穩(wěn)定蛋白質(zhì)的構(gòu)象，從而提高其耐熱性或其穩(wěn)定性。在天然酶分子上接一些化學(xué)基團(tuán)，可以得到多種多樣的修飾酶，只要選擇合適的修飾劑，利用化學(xué)修飾法可快速、廉價(jià)地提高酶的穩(wěn)定性，甚至可合成新的酶種。

枯草芽孢桿菌是食品上允許使用的微生物，而大腸桿菌BL21（DE3）在誘導(dǎo)表達(dá)下具有很強(qiáng)的分泌表達(dá)能力[9-10]，本課題研究中采用了來源于野生型、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的3種不同宿主的α-CGT酶，進(jìn)行分離純化得到純酶后再分析其熱穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，研究采用戊二醛交聯(lián)的化學(xué)修飾對熱穩(wěn)定性和酶活力造成的影響，以便為更好地工業(yè)化利用CGTase提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 表達(dá)α-CGT酶地野生型菌株P(guān) aenibacillus macerans、重組型菌株Bacillus subtilis WB600/pGJ103-CGT 和 Escherichia coli BL21（DE3）/pET-20b（+）-cgt均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏和構(gòu)建。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨和酵母粉，購自O(shè)xoid公司；標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白及SDS-PAGE試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。陰離子交換色譜填料Q-Sepharose和疏水色譜填料phenyl-Superose（HR10/10），購自美國 Amersham 公司。

1.1.3 儀器 紫外可見光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司產(chǎn)品；冷凍立式離心機(jī)（CF16RX），日本Hitachi公司產(chǎn)品；空氣恒溫?fù)u床，上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品；低壓層析系統(tǒng)及離子交換柱，上海層析設(shè)備廠產(chǎn)品；中空纖維膜超濾設(shè)備，AKTA蛋白純化系統(tǒng)，均為GE healthcare產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-CGT酶粗酶液的制備 搖瓶發(fā)酵來源于P.macerans，E.coli和 B.subtilis的 α-CGT 酶，將發(fā)酵液于4℃12 000 r/min離心20 min除菌體，收集培養(yǎng)物上清液。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度的測定 采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度[11]，使用牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 α-CGT酶環(huán)化活力的測定 用甲基橙法測α-CGT酶的環(huán)化活力:將發(fā)酵液在4℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液。發(fā)酵上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后取100 μL加入裝有900 μL底物的5 mL的離心管中，底物為50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液配制的1 g/dL可溶性淀粉溶液，在40℃水浴保溫反應(yīng)10 min，加入1 mL 1 mol/L的鹽酸終止反應(yīng)，再加入磷酸鈉緩沖液配制的0.1 mmol/L甲基橙染色，于20℃保溫20 min，在505 nm測定吸光度。一個酶活單位（U）定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環(huán)糊精所需的酶量。

1.2.4 α-CGT酶的純化 采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)對重組蛋白進(jìn)行純化，整個純化過程控制溫度為4℃。離心收集含有重組α-CGT酶的發(fā)酵上清液，緩慢溶解加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的（NH4）2SO4沉淀蛋白質(zhì)，4℃放置過夜，離心收集沉淀。用20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液復(fù)溶沉淀后，在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中透析過夜，期間更換2～3次透析緩沖液。

裝柱，用10倍柱體積的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液平衡陰離子交換柱Q-Sepharose；上樣，先用0.45 μm的微孔濾膜過濾樣品，將10 mL酶液用自動進(jìn)樣器上樣，保持體積流量為1 mL/min；洗脫，用平衡緩沖液將未吸附到柱體上的蛋白質(zhì)洗下來，洗脫體積為4～5個柱體積；吸附到柱上的蛋白質(zhì)用含 0～1 mol/L KCl的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液梯度洗脫，體積流量1 mL/min；收集目的蛋白質(zhì)。

含α-CGT酶的組分在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中透析過夜，緩慢加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%的固體（NH4）2SO4，用 10倍柱體積的內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20%（NH4）2SO4的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液平衡疏水柱phenyl-Superose（HR10/10）；1 mL/min上樣；吸附到柱上的蛋白質(zhì)用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 20%～0 的（NH4）2SO4的 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液反向梯度洗脫，體積流量1 mL/min。

含α-CGT酶的組分在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），純化的重組α-CGT酶置于-80℃保存。

1.2.5 不同來源的純化α-CGT酶熱穩(wěn)定性比較將蛋白質(zhì)含量為0.4 mg/mL、pH為6.0的純化源于P.macerans，E.coli和 B.subtilis的 α-CGT 酶，置于50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測其殘酶活，比較其穩(wěn)定性。

1.2.6 α-CGT酶的化學(xué)修飾 將純化的E.coli α-CGT酶用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，向4 mL蛋白質(zhì)含量為0.4 mg/mL的α-CGT酶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的戊二醛，其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%和1%，在4℃交聯(lián)1 h，然后將交聯(lián)后的α-CGT酶在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），去掉殘余的戊二醛，SDS-PAGE驗(yàn)證其交聯(lián)度，50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測其殘酶活，比較其穩(wěn)定性。

α-CGT酶粗酶制劑的交聯(lián)方法:先將粗酶液用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的（NH4）2SO4沉淀蛋白質(zhì)，4℃放置過夜，離心收集沉淀。然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛，對其進(jìn)行交聯(lián)，將交聯(lián)后的α-CGT酶在50 mmol/L pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中透析過夜（4℃），去掉殘余的戊二醛，50℃水浴30 min，測其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源的α-CGT酶的純化

作者所研究的α-CGT酶由野生型和兩種重組型的宿主分別表達(dá)，由于不同的宿主之間的生理代謝、蛋白質(zhì)合成及修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程各自不同，因此有可能導(dǎo)致所表達(dá)的酶的性質(zhì)也有所不同。為了分析3種不同來源的α-CGT酶的性質(zhì)，首先對其進(jìn)行了分離純化研究。將E.coli，B.subtilis和P.macerans 3種來源的發(fā)酵上清液通過鹽析、QSepharose陰離子交換色譜和phenyl-Superose（HR10/10）疏水色譜純化α-CGT酶。純化結(jié)果見表1，純化后的蛋白質(zhì)電泳圖見圖1。

表1 α-CGT酶的純化工藝Table 1 Purification scheme for α-CGTase

圖1 純化的α-CGT酶的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE analysis of the purification of α-CGTase

從表1可見，3種來源的α-CGT酶均得到了相對較高的回收率，SDS-PAGE證明了純化后酶蛋白的均一性，3種來源的α-CGT酶的比活相似，分別為 224.6 U/mg，211.5 U/mg和 233.8 U/mg。由此認(rèn)為另外兩種宿主 E.coli，B.subtilis重組表達(dá)的 α-CGT酶的催化活性沒有受到宿主本身的影響。

2.2 不同來源的純化α-CGT酶的熱穩(wěn)定性比較

將純化后的來源于 E.coli，B.subtilis和 P.macerans的α-CGT酶分別在50℃水浴30 min，每隔5 min取樣一次，測定其殘酶活，結(jié)果如圖2所示。

圖2 3種不同來源的純化α-CGT酶熱穩(wěn)定性比較Fig.2 Thermal stability of purified E.coli，B.subtilis and P.macerans α-CGTase culture supernatant

由圖 2可見，純化后的來源于 E.coli，B.subtilis和P.macerans的α-CGT酶的熱穩(wěn)定性稍有差別，50℃水浴30 min后，來源于E.coli的α-CGT酶還有21%的殘酶活，來源于B.subtilis的α-CGT酶還有28%的殘酶活，來源于P.macerans的α-CGT酶還有25%的殘酶活。因此來源于B.subtilis的熱穩(wěn)定性較好，但差別不顯著。Jeang等[12]的研究認(rèn)為可能是不同菌種周質(zhì)空間中決定酶折疊的催化蛋白質(zhì)種類不同造成了酶結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別，最終導(dǎo)致其穩(wěn)定性的差異；Wulfing等[13]的研究也認(rèn)為，蛋白質(zhì)在周質(zhì)空間中折疊獲得獨(dú)特的構(gòu)象是由細(xì)胞的獨(dú)特生理環(huán)境所決定的，不同來源的同種蛋白質(zhì)構(gòu)象的差異或許可以反映不同細(xì)菌其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的差異。但是，可以看出3種來源的α-CGT酶穩(wěn)定性均不是很好，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求?？紤]到E.coli的發(fā)酵產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于B.subtilis和P.macerans，因此下面的研究采用E.coli發(fā)酵所產(chǎn)的α-CGT酶進(jìn)行。

2.3 化學(xué)修飾對重組α-CGT酶穩(wěn)定性的影響

在蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾中，交聯(lián)酶聚集體技術(shù)[14]是一種新型化學(xué)修飾方法，近幾年被劃分到無載體固定化酶范疇，是采用物理方法使酶分子聚集，再經(jīng)交聯(lián)劑交聯(lián)而成。常用的交聯(lián)劑是戊二醛，其作用機(jī)理目前還未有準(zhǔn)確合理的解釋，但其對酶的交聯(lián)效果已有報(bào)道，Yamazaki等[15]對葡萄糖脫氫酶進(jìn)行交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)戊二醛交聯(lián)后可獲得耐熱性較好的交聯(lián)酶聚集體。因此作者擬研究液體純化α-CGT酶的戊二醛交聯(lián)以提高其穩(wěn)定性。

重組酶的化學(xué)修飾具體方法如材料與方法中所述。用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛對α-CGT酶進(jìn)行交聯(lián)，4℃反應(yīng)1 h，用pH 6，50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液透析過夜，除去殘留的戊二醛，并用SDSPAGE檢驗(yàn)交聯(lián)效果，見圖3。結(jié)果顯示，大部分α-CGT酶被成功交聯(lián)成大分子，并聚集在SDS-PAGE的頂端。

對其熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，將交聯(lián)與未交聯(lián)的α-CGT酶置于50℃水浴30 min，結(jié)果如圖4所示。可知，α-CGT酶交聯(lián)后相比于未交聯(lián)的α-CGT酶在50℃其熱穩(wěn)定性有所提高。交聯(lián)酶置于50℃水浴30 min后，仍有78%的酶活，而未交聯(lián)的α-CGT酶僅剩20%的殘酶活。但該過程存在一個缺點(diǎn)，就是交聯(lián)后的α-CGT酶其酶活損失過大，交聯(lián)后的α-CGT酶與原酶液相比，僅剩20%的殘酶活。有可能是戊二醛濃度過高，導(dǎo)致酶失活，因此考慮降低戊二醛的濃度，研究α-CGT酶的交聯(lián)。

圖3 戊二醛（1%）交聯(lián)α-CGT酶的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE analysis of cross-linking α-CGTase

圖4 戊二醛（1%）交聯(lián)α-CGT酶與重組α-CGT酶的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of cross-linking α-CGTase and recombinant α-CGTase

采用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的戊二醛對純化α-CGT酶進(jìn)行交聯(lián)，方法同質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的戊二醛交聯(lián)方法，SDS-PAGE檢測交聯(lián)效果，如圖5所示?？梢?，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的戊二醛交聯(lián)效果與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的戊二醛交聯(lián)效果差不多，大部分α-CGT酶被成功交聯(lián)成大分子，聚集在SDS-PAGE的頂端，但仍有部分游離的α-CGT酶。

將交聯(lián)與未交聯(lián)的α-CGT酶置于50℃水浴30 min，結(jié)果如圖6所示?？芍?，用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的戊二醛對α-CGT酶交聯(lián)后與用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%戊二醛交聯(lián)的α-CGT酶在50℃的熱穩(wěn)定性基本一致，與未交聯(lián)的α-CGT酶相比明顯提高。交聯(lián)后的α-CGT酶還有50%的酶活，與用終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的戊二醛交聯(lián)相比其酶活保留率有所提高，仍然存在交聯(lián)過程中酶活損失過大的問題，但可以肯定的是α-CGT酶的戊二醛交聯(lián)能夠明顯提高其熱穩(wěn)定性。作者還繼續(xù)進(jìn)行了質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%戊二醛來交聯(lián)α-CGT酶的穩(wěn)定性研究實(shí)驗(yàn)，但是由于0.25%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛交聯(lián)效果較差，導(dǎo)致交聯(lián)前后α-CGT酶的穩(wěn)定性幾乎沒有變化。

圖5 戊二醛（0.5%）交聯(lián)α-CGT酶的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of cross-linking α-CGTase

圖6 戊二醛（0.5%）交聯(lián)α-CGT酶與重組α-CGT酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of cross-linking α-CGTase and recombinant α-CGTase

3 結(jié)語

作者在實(shí)驗(yàn)室前期工作實(shí)現(xiàn)了α-CGT酶高效表達(dá)的基礎(chǔ)上，針對重組酶存在的穩(wěn)定性問題開展研究。發(fā)現(xiàn)3種不同來源的α-CGT酶的酶活和熱穩(wěn)定性差別不大，對E.coli重組表達(dá)的α-CGT酶首次采用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)修飾，將α-CGT酶交聯(lián)成大分子后，50℃水浴30 min仍有78%的酶活，而未交聯(lián)的α-CGT酶僅剩20%的殘酶活，交聯(lián)后酶活保有率提高了2.9倍。雖然由于交聯(lián)的無序性，導(dǎo)致較多的酶活性中心可能受到修飾而降低了酶活力，但是化學(xué)修飾卻可以明顯提高酶的熱穩(wěn)定性，為下一步大規(guī)模開發(fā)α-CGT酶工業(yè)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。此外，為了更精確地控制生物催化劑的性能，仍然需要開發(fā)更加特異性的修飾方法。如建立在準(zhǔn)確了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系上的酶的化學(xué)修飾法與基因工程技術(shù)相結(jié)合的酶的定向修飾技術(shù)，或許是值得嘗試的方法之一。

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