樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)小腸移植免疫耐受的研究進(jìn)展

楊 洋 綜述，沈中陽，宋紅麗 審校

（天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院器官移植中心，天津300192）

目前，對于小腸功能衰竭合并全胃腸外營養(yǎng)（total parenteral nutrition，TPN）并發(fā)癥的患者，小腸移植已成為公認(rèn)的唯一能夠挽救生命的治療手段。隨著新型免疫抑制劑的應(yīng)用和外科技術(shù)的改進(jìn)，臨床小腸移植療效得到很大改善。根據(jù)第十二屆世界小腸移植大會報(bào)告（www.isbts2011.org）顯示，1985年4月-2011年8月，全球共有79個(gè)移植中心完成小腸移植2611例，其中1341例患者仍存活[1]，目前全球的小腸移植患者的總體1年和5年生存率已分別超過70%和50%。但是，與其他實(shí)質(zhì)性臟器移植比較，小腸移植的效果仍不盡人意。移植后排斥繼感染之后，成為小腸移植術(shù)后死亡的第二大原因。誘導(dǎo)供體特異性移植耐受（donor specific transplant tolerance，DSTT）是近年來移植免疫耐受的研究重點(diǎn)，人們試圖通過誘導(dǎo)DSTT使移植物與宿主之間免疫反應(yīng)達(dá)到平衡，從而防止移植后排斥反應(yīng)的發(fā)生。近年來，隨著對抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）特別是樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）的深入研究，發(fā)現(xiàn)DC不僅是最有效的APC而且是目前發(fā)現(xiàn)唯一能激活初始T細(xì)胞的APC，因此調(diào)控或干擾受體DC的致敏途徑在誘導(dǎo)移植免疫耐受方面起著重要作用。

1 DC的生理功能

樹突狀細(xì)胞由Steinman于1973年首次發(fā)現(xiàn)，是一類具有典型樹突狀形態(tài)的細(xì)胞，細(xì)胞膜表面高表達(dá)MHCII類分子和一些相對特異性表面標(biāo)志，能夠移行至淋巴器官刺激初始T細(xì)胞活化增殖。DC根據(jù)來源分為髓樣DC和淋巴樣DC（或漿細(xì)胞樣DC）。正常情況下體內(nèi)絕大多數(shù)DC處于未成熟狀態(tài)，低表達(dá)共刺激分子和粘附分子，體外激發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR）的能力較弱，但具有較強(qiáng)的抗原內(nèi)吞和加工處理能力。DC在接受抗原和某些刺激因素刺激后分化成熟，高表達(dá)MHC I、II類分子、共刺激分子以及粘附分子（ICAM-1），體外激發(fā)MLR的能力很強(qiáng)，但抗原攝取加工能力大大降低。DC在成熟的同時(shí)，由外周組織進(jìn)入淋巴管，激發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答。T細(xì)胞接受抗原刺激而激活，需要兩個(gè)刺激信號?！暗谝恍盘枴睘門細(xì)胞表面TCR/CD3與抗原MHC分子結(jié)合的抗原特異性信號，“第二信號”為APC上的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合的抗原非特異性信號。共刺激分子提供的“第二信號”在T細(xì)胞活化上起重要作用，如果僅有“第一信號”，T細(xì)胞不能發(fā)生活化增殖，而且，在抗原識別時(shí)“第二信號”的缺乏將導(dǎo)致抗原特異性T淋巴細(xì)胞無能或凋亡。DC作為專職的APC，對免疫反應(yīng)的進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用，因此也是誘導(dǎo)移植免疫耐受的關(guān)鍵所在。

2 DC與小腸移植免疫耐受

2.1 中樞免疫耐受 克隆清除或克隆無反應(yīng)理論認(rèn)為，T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育過程中與自身MHC抗原發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過陰性選擇后，能與自身抗原發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞被清除[2]，而對自身抗原不發(fā)生反應(yīng)的T細(xì)胞發(fā)育為成熟的T細(xì)胞遷出胸腺。盡管可能有一系列細(xì)胞參與了T細(xì)胞成熟過程中的陰性選擇，但DC在其中起最重要的作用。如果T細(xì)胞在胸腺內(nèi)接觸到外周血DC攜帶的外周異基因抗原，就會被誘導(dǎo)出對該異基因抗原供體外周移植物的耐受作用。因此，可以將供體特異性抗原注入受體胸腺而誘導(dǎo)DSTT。1990年P(guān)osselt等[3]建立了大鼠胸腺內(nèi)注射誘導(dǎo)耐受的動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)Wistar大鼠胸腺內(nèi)注射Lewis大鼠的胰島細(xì)胞同時(shí)應(yīng)用抗淋巴細(xì)胞血清可使移植胰島長期存活（>200d）。而將Lewis大鼠休眠的T細(xì)胞注射到ACI大鼠胸腺內(nèi)聯(lián)合亞致死量全身照射能明顯延長小腸移植物存活時(shí)間[4]。此外，將供體骨髓細(xì)胞于術(shù)前注射到受體胸腺內(nèi)，能顯著減少小腸移植后急性排斥的發(fā)生，甚至可以促進(jìn)嵌合體的形成而誘導(dǎo)免疫耐受[5-6]。

2.2 外周免疫耐受 外周免疫耐受，即通過抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及其活性，或選擇性減弱或消除DC上共刺激分子表達(dá)和活性，阻斷共刺激信號，在只有抗原特異性刺激信號作用的情況下，誘導(dǎo)T細(xì)胞無能和凋亡，從而誘導(dǎo)移植免疫耐受。

2.2.1 誘導(dǎo)生成未成熟DC 未成熟DC（immature dendritic cells，iDC）通過下調(diào)共刺激分子，MHC-II和Th1細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)T細(xì)胞無能，因此維持DC的不成熟狀態(tài)可以誘導(dǎo)供體特異性免疫耐受[7]。通過控制體外培養(yǎng)條件（IL-10、糖皮質(zhì)激素等），再經(jīng)過脂多糖等刺激可以獲得iDC，并可觀察到其誘導(dǎo)免疫耐受的現(xiàn)象，而且這種iDC表型相對穩(wěn)定，不易進(jìn)一步分化成熟，可以持久發(fā)揮致耐受作用[8]。用GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-10誘導(dǎo)產(chǎn)生的iDC在體外均可抑制效應(yīng)性T細(xì)胞，且前者還能夠誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞無能，有利于免疫耐受的維持[9]。此外，1α，25（OH）D3與其受體結(jié)合后可特異性地抑制核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）家族中RelB的表達(dá)，從而抑制DC的分化成熟，并可抑制Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)移植耐受[10]。在大鼠小腸移植模型中，經(jīng)門靜脈注射供體骨髓來源的iDC可顯著延長受體存活時(shí)間，證實(shí)了iDC誘導(dǎo)免疫耐受的存在[11]。

2.2.2 基因修飾DC 基因修飾是針對移植免疫中抗原提呈、T細(xì)胞活化過程的主要環(huán)節(jié)，應(yīng)用不同的目的基因轉(zhuǎn)染DC，使其表達(dá)抑制免疫的表面分子、分泌免疫抑制因子或阻斷效應(yīng)T細(xì)胞活化，以達(dá)到誘導(dǎo)移植免疫耐受的目的。

IL-10是一種Th2細(xì)胞因子，能夠抑制Th1細(xì)胞因子合成，誘導(dǎo)Th1向Th2轉(zhuǎn)變。且應(yīng)用抗原和IL-10反復(fù)刺激可誘導(dǎo)特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregulatory cell，Treg）的增殖。這些都有利于免疫耐受的形成。IL-10與移植排斥反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)而與免疫耐受呈正相關(guān)[12]。經(jīng)IL-10修飾的DC輸注可使小腸移植受體大鼠存活時(shí)間明顯延長，排斥反應(yīng)程度更輕，驗(yàn)證了IL-10修飾的DC誘導(dǎo)小腸移植耐受的作用[13]。Hui等[14]也證實(shí)IL-10基因修飾DC，可以抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的致耐受作用。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）與DC的分化成熟和功能狀態(tài)關(guān)系密切，能夠抑制DC表面MHC抗原及共刺激分子的表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞抗原特異性低反應(yīng)而產(chǎn)生免疫耐受。在大鼠胰島移植中，通過TGF-β1基因修飾DC可使處理組胰島移植物存活時(shí)間明顯延長，提示TGF-β1-DC誘導(dǎo)了抗原特異性免疫耐受[15]。而在Wistar大鼠至SD大鼠肝移植的模型中，將TGF-β1基因修飾供體iDC經(jīng)尾靜脈輸給受體，移植排斥反應(yīng)明顯下降[16]。

此外，將CTLA4-Ig基因轉(zhuǎn)染的DC經(jīng)靜脈注射到心臟移植后的小鼠，能夠延長同種異基因小鼠移植物存活時(shí)間[17]。趨化因子受體-7（Chemokine receptor-7，CCR7）、INF-α、Fasl等基因修飾DC，均可誘導(dǎo)不同程度的移植免疫耐受。單基因修飾雖然顯示出誘導(dǎo)免疫耐受的性質(zhì)，但也表現(xiàn)出局限性，尚不能達(dá)到理想狀態(tài)的免疫耐受，聯(lián)合不同基因修飾DC協(xié)同誘導(dǎo)是今后器官移植耐受的一個(gè)研究方向。國內(nèi)有學(xué)者聯(lián)合應(yīng)用hFasL和hTGF-β1修飾iDC，發(fā)現(xiàn)可協(xié)同誘導(dǎo)同種異體大鼠肝移植免疫耐受，顯著延長肝移植大鼠的生存期[18]。

2.2.3 RNA干擾 RNA干擾（RNA Interference，RNAi）是利用構(gòu)建的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）或微小RNA（microRNA，miRNA）表達(dá)載體以特異的序列方式敲除目的基因表達(dá)。隨著近年RNAi技術(shù)的問世，應(yīng)用RNAi加工改造DC誘導(dǎo)移植耐受的研究也越來越多。siRNA轉(zhuǎn)染DC是高效的，并且可調(diào)控DC介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[19]。利用siRNA-IL-12p35轉(zhuǎn)染DC，可刺激異基因T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，促使IL-4表達(dá)上調(diào)而IFN-γ的表達(dá)下調(diào)，提示這種RNAi DC是一種致耐受DC，能維持機(jī)體的免疫耐受狀態(tài)，有望介導(dǎo)移植排斥的預(yù)防。Luo等[20]利用RNAi通過慢病毒載體有效沉默RelB基因來維持DC的不成熟狀態(tài)，從而誘導(dǎo)CD4+幼稚T細(xì)胞和CD4+記憶T細(xì)胞的低反應(yīng)性。同樣，利用siRNA也可沉默RelB基因而降低DC表面MHCII類分子和CD80，CD86分子的表達(dá)，阻礙了DC成熟，能夠明顯阻止同種異體大鼠心臟移植排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)移植免疫耐受[21]。此外，將CD40siRNA轉(zhuǎn)染到DC，使共刺激分子CD40在DC表面表達(dá)下降，這種DC刺激T細(xì)胞增殖的能力下降，并使IFN-γ分泌減少，IL-4分泌增加，誘導(dǎo)幼稚型T細(xì)胞向Th2方向分化，有利于免疫耐受的建立[22]。近來在大鼠小腸移植的研究中，應(yīng)用siRNA沉默骨髓源DC的髓樣分化因子88（My88）通路得到半成熟DC，有效抑制了同種異體T細(xì)胞的增殖，為誘導(dǎo)移植耐受提供了一種新的方法[23]。

2.2.4 調(diào)節(jié)性DC 調(diào)節(jié)性DC是一群異質(zhì)性的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，在維持機(jī)體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)方面有重要作用，其表面標(biāo)志具有多變性。低水平表達(dá)MHC分子及共刺激分子的調(diào)節(jié)性DC亞群，能夠誘導(dǎo)Treg生成，調(diào)節(jié)移植耐受。同時(shí)由于缺乏“第二信號”，不能活化初始T細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞無能而降低T細(xì)胞免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)性DC的致耐受作用也通過分泌具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子（IL-10，INF等）誘導(dǎo)免疫反應(yīng)向Th2偏倚而實(shí)現(xiàn)。Gregori等[24]利用1α，25（OH）D3誘導(dǎo)獲取的調(diào)節(jié)性DC聯(lián)合麥考酚嗎乙酯可以誘導(dǎo)對完全不相配的小鼠胰腺異體移植的耐受。而給自身免疫性腸病的小鼠輸入TGF-β基因修飾的調(diào)節(jié)性DC，可延緩了疾病的進(jìn)展，同樣證實(shí)調(diào)節(jié)性DC可以誘導(dǎo)免疫耐受[25]。

2.2.5 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 在生理狀態(tài)下，外周組織中存在著大量iDC，在一定條件下通過上調(diào)CCR7獲得向淋巴結(jié)遷移的能力，在此過程中不斷攝取移植物抗原及非感染環(huán)境中的蛋白質(zhì)，進(jìn)入局部淋巴結(jié)，激發(fā)T細(xì)胞前體分化為Treg細(xì)胞，而Treg又可反作用于iDC，一方面通過合成大量IL-10和TGF-β下調(diào)DC表面MHC-II的表達(dá)，另一方面通過組成性CTLA-4依耐性通路下調(diào)DC表面CD40、CD80、CD86等共刺激分子的表達(dá)，抑制T細(xì)胞的增殖及活性，誘導(dǎo)移植免疫耐受[26]。研究表明免疫耐受中存在著自我維持調(diào)節(jié)回路，即耐受性DC誘導(dǎo)初始型T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞，而Treg細(xì)胞則促進(jìn)DC前體形成耐受性DC，二者之間存在著負(fù)反饋機(jī)制而維持平衡，說明iDC介導(dǎo)的免疫耐受可能是通過誘導(dǎo)Treg細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的[27]。Treg細(xì)胞主要包括CD4+CD25+Treg細(xì)胞、Th3細(xì)胞Tr1細(xì)胞和 CD8+Treg細(xì)胞[28]。供體產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg細(xì)胞在體外可以有效地調(diào)控受體T細(xì)胞的產(chǎn)生，大劑量的Treg細(xì)胞注入受體，可能在人體肝移植免疫耐受中發(fā)揮重要作用[29]。Lim等[30]也發(fā)現(xiàn)，體外擴(kuò)增的CD4+CD25+Treg細(xì)胞聯(lián)合免疫抑制劑能夠有效地建立免疫耐受。

2.2.6 單克隆抗體 T細(xì)胞的活化增殖不僅需要“第一信號”，且依賴DC表面的共刺激分子與T細(xì)胞表面的受體結(jié)合產(chǎn)生的共刺激信號。應(yīng)用相應(yīng)的共刺激分子單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAb）及粘附分子mAb可以阻斷共刺激信號，從而誘導(dǎo)移植免疫耐受。如利用抗CD40LmAb阻斷CD40/CD40L通路，利用抗ICAM-1mAb阻斷LFA-1/ICAM-1通路。近年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用抗CD2mAb、抗CD58mAb及LFA-3融合蛋白阻斷CD2/CD58通路，明顯延遲了移植排斥反應(yīng)[31]。也有研究者用外源性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4免疫球蛋白融合蛋白（CTLA-4Ig）有效阻斷B7/CD28通路，從而有效誘導(dǎo)了大鼠小腸移植免疫耐受，延長了小腸移植物的存活時(shí)間[32]。

2.2.7 免疫抑制劑 研究發(fā)現(xiàn)，多種免疫抑制劑可影響DC成熟，從而在誘導(dǎo)和維持移植后耐受方面發(fā)揮重要作用。如LF15-0195（15-脫氧精胍菌素的異構(gòu)體）通過下調(diào)NF-κB和抑制IKK來抑制DC的成熟[33]。在大鼠骨髓來源的DC前體培養(yǎng)過程中加入環(huán)孢素A(1mg/L)，可以抑制DC表面共刺激分子的表達(dá)而發(fā)揮免疫耐受作用[34]。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過抑制骨髓來源DC的功能激活誘導(dǎo)CD4+CD25+foxp3+Treg細(xì)胞的生成，從而促進(jìn)器官移植免疫耐受[35-36]。

3 展望

器官移植是21世紀(jì)人類醫(yī)學(xué)的高峰，小腸移植因?yàn)閲?yán)重的排斥反應(yīng)而成為這座高峰上的一顆明珠，誘導(dǎo)移植后免疫耐受是小腸移植發(fā)展的重要突破點(diǎn)。作為體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，DC介導(dǎo)雙向的免疫調(diào)節(jié)作用，既可以提呈抗原激活T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，也可以誘導(dǎo)T細(xì)胞無能介導(dǎo)免疫耐受。有關(guān)DC誘導(dǎo)器官移植免疫耐受的研究在小腸移植方面有著廣闊的前景，特別是通過基因轉(zhuǎn)染以及RNAi等加工修飾DC，為免疫耐受的誘導(dǎo)提供了更多可選擇的方法，有望推動(dòng)小腸移植的進(jìn)一步發(fā)展。但同時(shí)也應(yīng)認(rèn)識到，DC誘導(dǎo)小腸移植免疫耐受真正應(yīng)用于臨床還有很多問題需要解決，有待于進(jìn)一步深入研究。

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