內(nèi)耳基因治療的研究進(jìn)展*

吳學(xué)文 綜 述 孫 虹 審 校

內(nèi)耳基因治療的研究進(jìn)展*

吳學(xué)文1，2綜 述 孫 虹1，2審 校

由于先天性異常、后天性損傷如病毒性疾病和耳毒性藥物以及老年退行性變等原因，內(nèi)耳疾病患者不斷增多。內(nèi)耳疾病主要表現(xiàn)為聽力下降和眩暈，重者導(dǎo)致語言交流障礙和行動困難，是一類嚴(yán)重影響人類正常生活的常見難治性、致殘性疾病。內(nèi)耳疾病的病理以耳蝸和/或前庭感覺上皮的細(xì)胞（如毛細(xì)胞和支持細(xì)胞）及神經(jīng)元不同程度受損為主，在臨床上表現(xiàn)為各種感音神經(jīng)性聾（如遺傳性聾、突發(fā)性聾、噪聲性聾、藥物性聾、老年性聾和自身免疫性聾等）及各類前庭周圍性眩暈（如梅尼埃?。┑取?/p>

迄今為止，大部分內(nèi)耳疾病仍無較為有效的治療方法。近年來，相關(guān)動物實驗研究表明，向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染特定的目的基因（如NT3［1］、Math1［2］、SOD1［3］等），能有效避免毛細(xì)胞和/或神經(jīng)元的死亡，并能提高實驗動物的聽覺功能，提示內(nèi)耳基因治療是一種非常有希望的治療手段。在內(nèi)耳基因治療研究領(lǐng)域中，各種新型基因載體、治療目的基因、給藥方法等方面的探索研究均取得了較大的進(jìn)展。本文從內(nèi)耳疾病的流行病學(xué)資料、內(nèi)耳基因治療發(fā)展歷史、研究現(xiàn)狀等進(jìn)行綜述。

1 致殘性內(nèi)耳疾病及其流行病學(xué)資料

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，2005年全球聽力殘疾人數(shù)2.78億，約占全球人口總數(shù)的4.6%；80%的聽力障礙者生活在中、低收入國家；WHO推測到2050年，全球聽力障礙的人數(shù)將上升至9億［4］。2006年我國各類殘疾人總數(shù)為8 296萬，其中聽力殘疾2 004萬，居殘疾人總數(shù)的第二位；7歲以下聾兒達(dá)80多萬，且每年新增聾兒3萬余名；50～80歲人群中，中度到重度感覺神經(jīng)性聾的患病率達(dá)50%［5］。中國貴州省的調(diào)查顯示，聽力減退患病率為17.1%，全國標(biāo)準(zhǔn)化患病率為17.6%；聽力殘疾患病率為6.1%，全國標(biāo)準(zhǔn)化患病率為6.5%；13.8%的調(diào)查對象需要耳科和聽力學(xué)干預(yù)［6］。因此，預(yù)防聾與聽力減退已成為全球關(guān)注的任務(wù)。

同樣需要關(guān)注的內(nèi)耳疾病是前庭性眩暈，以梅尼埃病和良性陣發(fā)性位置性眩暈為代表，具有復(fù)發(fā)性和難治性的特點，二者均為眩暈門診的常見?。?］。梅尼埃病的病因尚未明確，但反復(fù)發(fā)作的梅尼埃病也可導(dǎo)致耳蝸感覺細(xì)胞的退行性變，最終發(fā)展為聽力減退甚至聽力殘疾。

2 內(nèi)耳基因治療的發(fā)展歷史

基因治療是隨著DNA重組技術(shù)的成熟而發(fā)展起來的，它被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域的一次革命，是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)發(fā)展最重要的里程碑之一，同時也必將對傳統(tǒng)制藥業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響和沖擊［8］。

20世紀(jì)60年代末70年代初，國外研究者們首次用病毒包裹DNA片段后成功地將其轉(zhuǎn)染入小鼠和人類的胚胎細(xì)胞中，此后基因治療被認(rèn)為是未來治療一些難治性的遺傳性或基因突變疾病最有效的方法之一。基因治療在耳科研究中起步較晚，1996年Lalwani及Raphael分別用腺相關(guān)病毒和復(fù)制缺陷腺病毒成功地將目的基因轉(zhuǎn)染入豚鼠的內(nèi)耳細(xì)胞中。從21世紀(jì)初開始，國內(nèi)學(xué)者才開始嘗試活體動物的內(nèi)耳基因治療。2001年，郭維等［9］用腺病毒介導(dǎo)LacZ基因經(jīng)圓窗注入豚鼠內(nèi)耳，2天后LacZ基因成功表達(dá)于Corti器的內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、基底膜下的間皮細(xì)胞上。此后，陽離子脂質(zhì)體、無機(jī)納米材料等非病毒載體也被應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療。國內(nèi)外研究者們相繼利用各種病毒或非病毒載體將相關(guān)目的基因經(jīng)不同的轉(zhuǎn)染方式成功地轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)和/或活體動物的內(nèi)耳細(xì)胞內(nèi)。

3 內(nèi)耳基因治療的研究現(xiàn)狀

在基因治療方面，內(nèi)耳擁有其它器官無法比擬的優(yōu)勢。從解剖上，它相對封閉、處于骨性結(jié)構(gòu)包繞中，與周圍組織處于相對隔離狀態(tài)；流動的外淋巴有利于載體在整個耳蝸的鼓階與前庭階內(nèi)擴(kuò)散，而流動的內(nèi)淋巴有利于載體在整個膜蝸管內(nèi)擴(kuò)散［10］。目前內(nèi)耳基因治療的研究熱點主要集中在以下三個方面：①內(nèi)耳基因治療因子；②內(nèi)耳基因治療載體；③內(nèi)耳基因治療給藥途徑。

3.1 內(nèi)耳基因治療因子 目前用于內(nèi)耳基因治療研究的基因主要有六類：①神經(jīng)營養(yǎng)因子類［11～13］：神經(jīng)營養(yǎng)－3（neurotrophin－3，NT3）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain－derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子（glial cell line－derived nerve growth factor，GDNF）及其他類型生長因子等，神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入內(nèi)耳后，可有效抑制螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在外毛細(xì)胞死亡后的退行性變并可能促進(jìn)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突的再生；②抗凋亡基因：如XIAP［14］及Bcl－2家族［15］等，抗凋亡基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入內(nèi)耳后表達(dá)的相關(guān)產(chǎn)物能有效抑制耳毒性藥物如順鉑及慶大霉素的促凋亡作用而發(fā)揮保護(hù)作用；③b HLH轉(zhuǎn)錄因子家族：如Math1［2］及Hath1［16］等，成年動物內(nèi)耳中Math1或Hath1的過度表達(dá)可使Corti器出現(xiàn)新的類毛細(xì)胞，提示Math1或Hath1基因在內(nèi)耳成熟的非感覺上皮細(xì)胞向毛細(xì)胞分化中是必不可少的促進(jìn)因子；④抗氧化因子基因［3］：如超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）SOD1、SOD2，超氧自由基、羥自由基和過氧化氫等活性氧（reactive oxygen species，ROS）常引起耳蝸細(xì)胞不可逆的損害，導(dǎo)致噪聲性、藥物中毒性、缺血再灌注性及老年性等感音神經(jīng)性聾的發(fā)生，而SOD1及SOD2能有效拮抗耳蝸細(xì)胞中的氧化應(yīng)激作用而發(fā)揮保護(hù)聽力及毛細(xì)胞的作用；⑤耳蝸連接蛋白基因［17，18］：如CX26（GJB2）、CX30（GJB6）等；⑥耳蝸蛋白基因［19］（otospiralin）及白細(xì)胞介素1基因等。這些基因分別通過不同的機(jī)理對內(nèi)耳及耳蝸起保護(hù)作用或促進(jìn)毛細(xì)胞再生作用。

3.2 內(nèi)耳基因治療載體 當(dāng)代科技水平尚不能使人類內(nèi)耳毛細(xì)胞和神經(jīng)元在死亡后發(fā)生有效的再生，所以，促使病變的毛細(xì)胞和神經(jīng)元盡快恢復(fù)或避免死亡，是感音神經(jīng)性聾治療的關(guān)鍵［10］。由于內(nèi)耳特殊的生理解剖結(jié)構(gòu)——血腦屏障和血迷路屏障的存在，目前還沒有一種非常理想的載體應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療，因此，迫切需要開發(fā)一種安全、高效且具有組織特異性的內(nèi)耳基因治療載體。目前在基因治療研究領(lǐng)域，基因載體系統(tǒng)主要分為病毒型載體和非病毒型載體兩大類。

3.2.1 病毒型載體 Kawamoto等［12］經(jīng)鼓階鉆孔途徑用腺病毒成功地將Math1基因轉(zhuǎn)染至Corti器的支持細(xì)胞及周圍的非感覺上皮細(xì)胞。Ishimoto等［20］同樣用腺病毒成功地將lacZ基因轉(zhuǎn)染至Corti器的支持細(xì)胞；但鉆孔部位周圍的毛細(xì)胞受到損害，提示腺病毒可能存在一定的毒性。Lalwani等（1997）發(fā)現(xiàn)，用腺相關(guān)病毒（adeno－associated virus，AAV）介導(dǎo)報告基因綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行耳蝸轉(zhuǎn)染后，耳蝸內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)組織、螺旋緣、Corti器及前庭膜出現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光。Iizuka等［21］用AAV攜帶報告基因（GFP）經(jīng)鼓階鉆孔及圓窗膜注射途徑轉(zhuǎn)染耳蝸，發(fā)現(xiàn)除外毛細(xì)胞外幾乎所有的耳蝸組織如內(nèi)毛細(xì)胞、各種支持細(xì)胞及神經(jīng)元等出現(xiàn)不同強(qiáng)度的綠色熒光表達(dá)。Pietola等［22］將慢病毒HOX－GFP及WOX－GFP經(jīng)鼓階注射轉(zhuǎn)染CD－1小鼠后，分別在鼓階及前庭階的上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)。Derby等（1999）應(yīng)用I型單純皰疹病毒（herpes simplex type I virus，HSV－1）及狂犬病毒將大腸桿菌lacZ基因轉(zhuǎn)染至豚鼠耳蝸，使耳蝸內(nèi)包括Corti器細(xì)胞在內(nèi)的許多細(xì)胞成功表達(dá)lacZ基因。Praetorius等［23］用HSV－1攜帶報告基因通過橢圓囊開窗的方法對內(nèi)耳進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的前庭神經(jīng)元及耳蝸神經(jīng)元被成功轉(zhuǎn)染，并在轉(zhuǎn)染后第5天基因表達(dá)最強(qiáng)。此外，王俊等［24］應(yīng)用Bac－to－Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備重組桿狀病毒Bac－GFP后，體外轉(zhuǎn)染新生大鼠耳蝸Corti器模型，并通過圓窗膜直接將重組病毒顯微注射進(jìn)入豚鼠內(nèi)耳，結(jié)果顯示在體外Bac－GFP聯(lián)合丁酸鈉可以高效轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在體內(nèi)桿狀病毒可以有效轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

目前，已經(jīng)有多種病毒型基因載體被開發(fā)出來并應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療的實驗研究中，但病毒載體存在著潛在的免疫原性、致瘤性、致炎癥反應(yīng)及細(xì)胞毒性等缺點，還沒有一種病毒型載體能應(yīng)用于內(nèi)耳基因治療的臨床研究［2］。

3.2.2 非病毒型載體 相對于病毒型載體，非病毒型載體盡管轉(zhuǎn)染效率較低，但其具有無致瘤性、無免疫原性、低毒或無毒性、同時運載量相對較大等諸多優(yōu)點。近年來探索使用非病毒型載體向內(nèi)耳進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染成為研究熱點。

Maeda等［25］用脂質(zhì)體介導(dǎo)pGJB2（R75W）－eGFP通過圓窗膜途徑成功轉(zhuǎn)染耳蝸的內(nèi)外柱細(xì)胞、外毛細(xì)胞、Claudius細(xì)胞以及螺旋緣及螺旋韌帶細(xì)胞。蔣明等［21］報道通過陽離子脂質(zhì)體攜帶構(gòu)建的p EGFPC2－NT3轉(zhuǎn)染小鼠耳蝸原代培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，在基因轉(zhuǎn)染后24 h在熒光顯微鏡下觀察到胞體及軸突發(fā)出綠色熒光的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。Noushi等［26］將藻酸鹽顆粒裝載NT3后置于豚鼠圓窗膜上或植入耳蝸鼓階，28天后發(fā)現(xiàn)，這2種方法對耳蝸聽神經(jīng)元的退行性變和凋亡均有保護(hù)作用。由于陽離子脂質(zhì)體和其他陽離子聚合物均存在潛在的細(xì)胞毒性且轉(zhuǎn)染效率相對較低的問題，目前研究人員致力于通過改變其本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)及相關(guān)配體修飾，使之更好的滿足實驗及臨床基因治療的需要。

納米基因載體是指載體粒徑在納米級（1～100 nm）范圍內(nèi)的非病毒載體，是近年發(fā)展的一種新型非病毒型載體。Kopke等［27］用經(jīng)過表面處理的四氧化三鐵納米顆粒置入動物中耳，納米顆粒在恒定的磁場作用下可穿過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳，也可進(jìn)入中耳黏膜內(nèi)。Praetorius等［28］發(fā)現(xiàn)Cy3標(biāo)記的硅納米粒在經(jīng)完整圓窗膜給藥后，能順利滲透過圓窗膜，在耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、前庭毛細(xì)胞以及腦干組織中均被檢測到。Zou等［29］應(yīng)用以脂質(zhì)體核心的納米載體經(jīng)完整圓窗膜給藥后，發(fā)現(xiàn)該納米順利地通過圓窗膜到達(dá)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維及內(nèi)耳其他細(xì)胞。羥基磷灰石納米顆粒（hydroxyapatite nanoparticles，n HAT）作為一種新型無機(jī)納米基因轉(zhuǎn)運載體，自其研發(fā)以來一直受到基因治療領(lǐng)域許多研究者的密切關(guān)注［11，12，30，31］，n HAT在生產(chǎn)上具有制備簡單、儲存方便的特點，且具有良好的生物相容性，幾乎無細(xì)胞毒性，是一種較為理想的基因載體工具。蔣明［31］等發(fā)現(xiàn)n HAT介導(dǎo)NT3轉(zhuǎn)染處于興奮毒性損傷急性期的豚鼠病變耳蝸后，能有效阻止和部分逆轉(zhuǎn)其聽覺損害。

納米載體具有非病毒型載體的多項優(yōu)點，其粒徑更小、毒性更低、生物相容性更佳，能穿過組織間隙并被細(xì)胞吸收，可通過人體最小的毛細(xì)血管和血腦屏障［32］。納米顆粒可通過靜電作用和共價結(jié)合使其能在表面結(jié)合DNA，同時能保護(hù)其表面的核酸不受核酸酶的降解，有效地延長作用時間［33］。而且，納米顆粒在體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)外具有很好的穩(wěn)定性，不易被降解及消化。納米載體的這些特性使其在藥物和基因輸送方面具有許多優(yōu)越性，用納米材料作為基因治療載體成為該領(lǐng)域的研究熱點和趨勢。

3.3 內(nèi)耳基因治療給藥途徑的研究現(xiàn)狀 內(nèi)耳器官作為精密的聽覺和平衡器官，不宜反復(fù)施行創(chuàng)傷性手術(shù)；由于內(nèi)耳存在血迷路屏障，全身給藥往往療效欠佳且副作用較大，同時一些大分子物質(zhì)如生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等難以通過血迷路屏障并輸送到內(nèi)耳靶部位而發(fā)揮其生物學(xué)作用。因此，探索一種安全有效的內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)移方法是開展內(nèi)耳基因治療的重要前提之一。

目前在動物研究中多采用內(nèi)耳局部給藥方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染治療，經(jīng)耳蝸鼓階鉆孔微量灌注［12，25，31］和經(jīng)圓窗膜內(nèi)耳微量注射［21，22，24，33，34］是常用的辦法；同時也有研究者們嘗試經(jīng)圓窗膜滲透給藥的方法［25，26，28，29，30～36］；此外還有經(jīng)前庭階［37］、中階［20］、后半規(guī)管［38］、外半規(guī)管［39］、前庭開窗術(shù)［23］、內(nèi)淋巴囊（yamasoba，1999）、腦脊液［10?等轉(zhuǎn)染途徑。其中，除經(jīng)圓窗膜滲透給藥方法外，其他方法操作均較復(fù)雜，要求術(shù)者有較高的手術(shù)技巧，且可能造成手術(shù)部位局部的損傷，甚至有引起內(nèi)耳感染導(dǎo)致全聾的風(fēng)險，在很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。因此，經(jīng)圓窗膜滲透是向內(nèi)耳基因轉(zhuǎn)染的較為理想的途徑。然而，由于圓窗膜解剖結(jié)構(gòu)的變異，臨床上有部分患者的圓窗膜外側(cè)還可能存在圓窗龕膜或其他纖維組織和脂肪團(tuán)，增加了經(jīng)圓窗膜給藥的難度。此外，目前圓窗膜給藥劑量尚未定量及標(biāo)準(zhǔn)化，藥物的滲透方式、釋放速率及持續(xù)作用時間等尚未完全明確。

4 展望

目前限制基因治療向臨床應(yīng)用推進(jìn)的“瓶頸”是缺乏理想的基因載體。相對于病毒型載體而言，非病毒型載體尤其是納米載體更安全，使得其在基因治療領(lǐng)域展示出明顯的優(yōu)勢，有可能成為在臨床上基因治療的載體；但各種非病毒納米載體的轉(zhuǎn)染效率都相對較低，達(dá)不到臨床實用的要求。為了提高基因轉(zhuǎn)染效率，很重要的一個研究方向就是提高載體的靶向性及其與組織細(xì)胞的親和力。由于納米粒子表面具有高度的可修飾性，因此納米載體的轉(zhuǎn)染率可通過對納米顆粒的形態(tài)、粒徑、表面修飾、加工條件等進(jìn)行改良以及應(yīng)用環(huán)境和給藥途徑的改善而得到大大地提高［11］。Wu等［35］用改良后的n HAT（經(jīng)PEI表面修飾后的n HAT）介導(dǎo)重組質(zhì)粒p EGFPC2－NT3經(jīng)完整圓窗膜途徑向內(nèi)耳轉(zhuǎn)染48小時后，發(fā)現(xiàn)橢圓囊及壺腹嵴周圍支持細(xì)胞區(qū)域中幾乎所有的暗細(xì)胞都出現(xiàn)EGFP的顯著表達(dá)；球囊、橢圓囊及壺腹嵴的大量毛細(xì)胞也出現(xiàn)EGFP的明顯表達(dá)，提示改良后的n HAT在內(nèi)耳基因治療中有較大應(yīng)用前景。

近年來，國外有人制造出一種由病毒DNA序列和非病毒載體結(jié)構(gòu)共同組成的復(fù)合型載體［41，42］，具有病毒和非病毒載體的優(yōu)點，又避免了兩者的缺點。甚至有研究者，用納米顆粒攜帶目的基因后與細(xì)菌相連接，開發(fā)出一種細(xì)菌性基因載體系統(tǒng)，并在靶細(xì)胞中成功表達(dá)出目的基因［43］。這些復(fù)合型載體，也許是未來基因治療載體的發(fā)展方向之一。

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（2012－06－11收稿）

（本文編輯 周濤）

10.3969/j.issn.1006－7299.2013.03.031

時間：2013－5－6 15：44

R764.3

A

1006－7299（2013）03－0311－05

* 教育部博士點基金（20110162110007）、國家自然科學(xué)基金（81170912，30772402）、湖南省自然科學(xué)基金（02JJY2050）聯(lián)合資助

1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科（長沙 410008）； 2 耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重點實驗室

孫虹（Email：shjhaj＠vip.163.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20130506.1544.005.html