結(jié)直腸癌的DNA甲基化研究進(jìn)展

李曉陽 顏才華 馬一杰 陳小兵 羅素霞

鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，河南鄭州 450008

結(jié)直腸癌是全世界癌癥死亡的主要原因之一，它的發(fā)生由一系列遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)方面的改變使正常的上皮組織發(fā)展為浸潤性癌的過程。這個(gè)過程首次在Fearon和Vogelstein設(shè)計(jì)的典型的腺瘤癌癥發(fā)展模型中被提出[1]。該模型的提出，使我們對結(jié)直腸癌分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識大幅提高，目前認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生涉及多種分子通路，包括基因突變和表觀遺傳學(xué)改變[2]。過去十年，關(guān)于腫瘤表觀遺傳學(xué)的研究已取得了重大的進(jìn)步，特別是DNA異常甲基化方面。對結(jié)直腸癌表觀遺傳學(xué)進(jìn)行研究，可進(jìn)一步揭示結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制，為結(jié)直腸癌臨床診斷、治療和預(yù)后評價(jià)提供重要生物學(xué)標(biāo)志。

1 表觀遺傳學(xué)簡介

表觀遺傳學(xué)是指不涉及DNA序列改變的情況下，基因的表達(dá)與功能發(fā)生改變并產(chǎn)生可遺傳的表型?；虮磉_(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控發(fā)生于正常的組織，在胚胎發(fā)育、基因印記和組織分化中發(fā)揮重要作用[3]。異常的表觀遺傳學(xué)改變最早于1982年在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，從此開啟了對表觀遺傳學(xué)研究的熱潮，包括調(diào)控正常組織和癌組織中基因表達(dá)的一系列復(fù)雜的表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制[4]。表觀遺傳學(xué)修飾很大程度上影響著核染色質(zhì)凝固狀態(tài)，決定了DNA能否正常表達(dá)蛋白質(zhì)，調(diào)控著基因轉(zhuǎn)錄。“開放”的染色質(zhì)狀態(tài)可進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，相反，濃縮或者“關(guān)閉”的染色質(zhì)狀態(tài)阻止基因轉(zhuǎn)錄[3]。目前在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用的表觀遺傳學(xué)機(jī)制有以下幾方面：①CpG島區(qū)域胞嘧啶的DNA甲基化；②組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾；③siRNA和miRNA；④核小體定位[3]。在這篇綜述里將重點(diǎn)介紹DNA甲基化，因?yàn)樗诮Y(jié)直腸癌表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制中研究的最為廣泛。

2 DNA甲基化及其在大腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用

2.1 DNA甲基化

DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)[5]。通常，最易被DNMT作用的是CG二核苷酸序列，即CpG。正常哺乳動物細(xì)胞的大多數(shù)CpG序列存在甲基化，非甲基化CpG序列僅存在DNA的CpG島區(qū)域。CpG島通常被定義為GC含量大于50%，長度大于200～500個(gè)堿基的一段序列，并且觀測到的CpG比例較預(yù)測的比例高0.6[6]。60%～70%的基因啟動子區(qū)域含有CpG島，并且處于非甲基化狀態(tài)，在腫瘤中，他們發(fā)生異常甲基化。啟動子區(qū)域CpG島的甲基化與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)，發(fā)生在基因啟動子區(qū)域以外CpG位點(diǎn)的甲基化稱為基因體甲基化，與轉(zhuǎn)錄失活無關(guān)，而與轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)[7]。

基因的甲基化模式對基因表達(dá)的調(diào)控至關(guān)重要。CpG甲基化可以通過多種機(jī)制導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活，如直接抑制順式作用原件AP-2、CREB、E2F等[8]。DNA甲基化的一個(gè)重要機(jī)制是通過與調(diào)節(jié)核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的酶合作交互調(diào)控基因表達(dá)。這種合作交互機(jī)制與一種甲基結(jié)合蛋白（PcG）有關(guān)，通過與高親和力的甲基化DNA結(jié)合導(dǎo)致級聯(lián)放大反應(yīng)，招募蛋白質(zhì)改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)控組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化及染色質(zhì)重塑，從而使染色質(zhì)固縮并封閉轉(zhuǎn)錄因子到啟動子區(qū)域的通道[9]。DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑之間的相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜，存在各種各樣的串話。異常的DNA甲基化有可能改變?nèi)旧|(zhì)重塑和基因表達(dá)，組蛋白及其修飾蛋白的調(diào)節(jié)異常可能導(dǎo)致異常的DNA甲基化。研究表明PcG蛋白復(fù)合體PRC2的異常活化可能是誘導(dǎo)腫瘤中DNA異常甲基化的機(jī)制之一[10]。

2.2 DNA甲基化與年齡因素

年齡是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，老化的腸黏膜表現(xiàn)為年齡相關(guān)的整個(gè)基因組的低甲基化和某些特定區(qū)域的高甲基化。起初認(rèn)為組織結(jié)構(gòu)正常的腸上皮細(xì)胞上的ESR1、IGF2和TUSC3基因的異常甲基化與年齡相關(guān)，隨后發(fā)現(xiàn)另外一些基因也存在年齡相關(guān)性甲基化[11]。約50%年齡相關(guān)性甲基化基因與結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制相關(guān)的基因是相同的，這表明年齡相關(guān)性基因在增加腫瘤易感性上起到一定的作用。有研究表明年齡相關(guān)性DNA甲基化和腫瘤相關(guān)性DNA甲基化機(jī)制可能是相同的，然而年齡相關(guān)性異常甲基化的機(jī)制仍不清楚[12]。在老年人正常組織中檢測到異常DNA甲基化提示高齡腸癌患者比低齡者存在更多的表觀遺傳學(xué)驅(qū)動事件[13]。

2.3 DNA甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展

目前認(rèn)為在多數(shù)結(jié)直腸癌基因組中存在成百上千個(gè)異常甲基化基因，且只有一部分可能與這些腫瘤的發(fā)生有重要關(guān)系。在正常黏膜向腺瘤，息肉向腫瘤的進(jìn)展過程中，可以顯而易見地看到發(fā)生甲基化的基因大幅增加，比較正常黏膜和早期腺瘤，早期腺瘤和進(jìn)展期腺瘤，甲基化基因在不段大幅增加[14]。Esteller[15]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸腺瘤中MGMT、MLH1等DNA修復(fù)基因的異常甲基化可能促進(jìn)腺瘤發(fā)生惡變。

Toyota等[16]于1999年提出了這些腫瘤中有一個(gè)獨(dú)特的分子發(fā)病機(jī)制，稱為CpG島甲基化表現(xiàn)型（CIMP），且接近20%的結(jié)直腸癌是CIMP腫瘤。CIMP可在進(jìn)展期管狀腺瘤中檢測到，但是在管狀腺瘤早期卻不是普遍能檢測到的[15]。目前尚不清楚在息肉形成結(jié)直腸癌的晚期能否檢測到CIMP。另外，CIMP腫瘤中存在高突變率的BRAF基因，并且常發(fā)生在女性的右半結(jié)腸[17-18]。有研究對125例結(jié)直腸癌標(biāo)本進(jìn)行了全基因組DNA甲基化性能分析，將CIMP腫瘤分為CIMP-H和CIMP-L，前者表現(xiàn)為異常高頻的腫瘤特異性DNA甲基化，與MLH1甲基化和BRAF突變密切相關(guān)[19]。目前CIMP腫瘤發(fā)生的潛在原因還不清楚，但已表明與吸煙有關(guān)，同時(shí)有證據(jù)表明與營養(yǎng)狀態(tài)、體型、身體活動情況等也有一定關(guān)聯(lián)[20]。然而，總體來看，DNA的異常甲基化主要涉及結(jié)直腸癌形成的早期事件，較少涉及進(jìn)展期事件。

3 DNA甲基化在結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用中的價(jià)值

3.1 DNA甲基化與結(jié)直腸癌的早期診斷

對于將甲基化基因作為結(jié)直腸癌特異性生物學(xué)標(biāo)志物，目前最先進(jìn)的用途是基于DNA水平的結(jié)直腸癌的篩查。雖然目前腸鏡仍是結(jié)直腸癌篩查最準(zhǔn)確的方法，但是由于該檢查操作程序較復(fù)雜及存在一定的并發(fā)癥，患者依從性欠佳。盡管大便潛血檢查價(jià)格便宜且操作簡單，但靈敏性和特異性相對較低。筆者對結(jié)直腸癌分子病理學(xué)方面的研究進(jìn)展，已將這些有應(yīng)用前景的早期檢測分子標(biāo)記用于結(jié)直腸癌的非侵襲性篩查。啟動子區(qū)域的一些基因在早期結(jié)直腸癌中存在高甲基化，可作為早期檢測標(biāo)志物。糞便中的甲基化波形蛋白是已得到驗(yàn)證的結(jié)直腸癌早期檢測標(biāo)記，人波形蛋白基因（VIM）在53%～84%的結(jié)直腸癌患者中存在異常甲基化，有報(bào)道提出靈敏度達(dá)到83%，特異性達(dá)到82%[21]。另外，在歐洲和中東已將檢測外周血中甲基化SEPT9基因的檢測用于結(jié)直腸癌篩查，目前正不斷地在提高用糞便、血漿進(jìn)行甲基化分析達(dá)到臨床用途的可行性[21]。

3.2 DNA甲基化與結(jié)直腸癌療效及預(yù)后評價(jià)

由于CpG島高甲基化和整體DNA的低甲基化之間的相反關(guān)系，對關(guān)于結(jié)直腸癌臨床應(yīng)用的表觀遺傳學(xué)標(biāo)志的研究主要集中在基因的甲基化，本課題組研究發(fā)現(xiàn)TIP30啟動子在高轉(zhuǎn)移性、低分化的大腸癌細(xì)胞株HCT116和非高轉(zhuǎn)移性的大腸癌細(xì)胞株HT29中存在CpG島高甲基化，這可能是抑癌基因TIP30表達(dá)降低或缺失的機(jī)制之一[22]，與筆者前期關(guān)于大腸癌組織中TIP30蛋白表達(dá)情況[23]及TIP30過表達(dá)能抑制大腸癌細(xì)胞生長，降低其侵襲、遷移能力[24]等研究結(jié)果相一致。另外，還發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌TIP30啟動子甲基化狀態(tài)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及對5-FU、奧沙利鉑化療藥物的敏感性相關(guān)[22,25]。

Ide等[26]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤CIMP狀態(tài)可作為5-FU反應(yīng)性的預(yù)測標(biāo)記，然而目前關(guān)于CIMP狀態(tài)與5-FU輔助治療反應(yīng)性之間的尚存在相互矛盾的數(shù)據(jù)。低甲基化的LINE-1作為一種生物學(xué)標(biāo)志已在研究，近來Ahn等[27]研究表明，甲基化的LINE-1有望成為近端結(jié)直腸癌無病生存期較短的預(yù)后指標(biāo)，且腫瘤復(fù)發(fā)患者LINE-1的甲基化水平較無復(fù)發(fā)者低。然而，迄今為止的數(shù)據(jù)還不足以支持將基因甲基化作為預(yù)測性生物指標(biāo)。

4 結(jié)論

在過去十年里，表觀遺傳學(xué)對腫瘤發(fā)病機(jī)制作用的研究取得了飛速發(fā)展，現(xiàn)已明確表觀遺傳學(xué)事件是結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的驅(qū)動事件，表觀遺傳學(xué)事件與基因突變共同參與正常腸黏膜向結(jié)直腸癌進(jìn)展的過程，而且結(jié)直腸癌基因組中受異常DNA甲基化影響的基因較受基因突變影響的基因多。異常DNA甲基化的研究為結(jié)直腸癌的早期診斷、預(yù)后判斷和干預(yù)治療提供了新的思路，并且已經(jīng)展現(xiàn)了良好的前景。

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