硫化氫抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移P C-3細(xì)胞增殖和侵襲的體外研究

黃新宇 楊遠(yuǎn)良 許國(guó)華 容錫滄 馮瑞強(qiáng)

1.廣東省江門市人民醫(yī)院骨科，廣東江門 529000；2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院骨一科，廣東廣州 511400

前列腺癌發(fā)病率居美國(guó)男性惡性腫瘤中第一位[1]，每年因前列腺癌死亡的患者數(shù)僅次于肺癌居第二位，其發(fā)病率在我國(guó)也呈逐年升高趨勢(shì)。前列腺癌最易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，85%～100%死于前列腺癌的患者中合并骨轉(zhuǎn)移[2]。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移后臨床上缺乏有效的治療手段，其確切轉(zhuǎn)移機(jī)制目前也不十分清楚[3-4]。因此，探尋新的治療前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的方式及藥物很有必要。硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）是一種能溶于水有臭雞蛋氣味的氣體，作為一種氣體信號(hào)分子受到越來越廣泛的研究[5]。在哺乳動(dòng)物、魚類乃至無脊椎動(dòng)物體內(nèi)，都可以生成內(nèi)源性H2S氣體，發(fā)揮類似神經(jīng)遞質(zhì)的中樞調(diào)節(jié)作用。H2S發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制是調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和凋亡[6-7]，Li等[8]報(bào)道硫化氫促進(jìn)惡性膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，Cao等[9]報(bào)道硫化氫導(dǎo)致胰腺腺癌細(xì)胞凋亡。目前的研究發(fā)現(xiàn)，釋放硫化氫的非甾體抗炎藥提高其對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗癌作用[10]，但機(jī)制還不太明確。本試驗(yàn)以硫氫化鈉（sodium hydrosulfide，NaHS）作為硫化氫的供體，探討硫化氫對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲的影響，并初步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

NaHS購(gòu)自Sigma公司；cck-8購(gòu)自同仁公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；抗 Bcl-2、抗 Bax和 Western-Blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cell Signaling Technology Inc。細(xì)胞蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞系PC-3購(gòu)自ATCC，細(xì)胞置于含10%胎牛血清F-12培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

根據(jù) NaHS濃度將實(shí)驗(yàn)分為 0、1、2、4 mmol/L四組，每組均作用PC-3細(xì)胞36 h，檢測(cè)不同濃度下細(xì)胞存活率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以10 000個(gè)/孔接種于96孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜待細(xì)胞貼壁，用含有不同處理因素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。處理結(jié)束后加入CCK-8（每孔 100 μL 加 10 μL CCK-8），輕搖，37℃孵育 4 h，然后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定每孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）。取5孔OD值的平均值，按公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率，存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組 OD-空白對(duì)照組 OD）/（正常對(duì)照組OD-空白對(duì)照組OD）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以0 mmol/L NaHS組為對(duì)照組，存活率為100%。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用0、1、2、4mmol/L NaHS分別作用PC-3細(xì)胞36h后，在具有8 μm小孔聚碳酸酯濾膜的培養(yǎng)小室上鋪用預(yù)冷無血清F-12培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，接種100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋的 PC-3細(xì)胞（5×105個(gè)/mL），下室加入600 μL含10%血清的F-12培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)小室，用棉簽輕輕拭去未穿過濾膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min。倒置熒光顯微鏡下觀察、照相，并每組隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)每高倍視野濾膜底面的平均細(xì)胞數(shù)。

1.5 ELISA檢測(cè)PC-3上清液MMP-2、MMP-3分泌

用0、1、2、4mmol/LNaHS分別作用PC-3細(xì)胞36 h后，胰酶消化細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，1%血清的F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，收集上清液，4℃離心，ELISA檢測(cè)PC-3上清液MMP-2、MMP-9分泌情況，以0 mmol/L NaHS組為對(duì)照組，分泌量為100%。

1.6 Western-Blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

PC-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%滿時(shí)按各試驗(yàn)組要求加入不同處理因素。按操作說明書提取細(xì)胞胞漿蛋白和核蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDSPAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1.5 h。隨后加入抗 Bcl-2（1∶1000）或抗 Bax（1∶1000）或抗GAPDH（1∶3000）4℃孵育過夜，TBST 漂洗 7 min×3 次，加入相應(yīng)的二抗（羊抗兔 IgG 1∶3000），常溫孵育 1 h，TBST 漂洗10 min×3次。將PVDF膜用發(fā)光劑顯色后曝光到X光片上。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NaHS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞存活率的影響

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分別作用 PC-3 細(xì)胞 36 h，與對(duì)照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組細(xì)胞存活率降低。1 mmol/L NaHS組細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；2、4 mmol/L組與對(duì)照組比細(xì)胞存活率下降NaHS作用PC-3細(xì)胞36 h，細(xì)胞存活率降低，與對(duì)照組比較，能不同程度抑制PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖1。

圖1 NaHS降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞存活率

2.2 NaHS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞侵襲的影響

用 0、1、2、4 mmol/L NaHS 分別作用 PC-3 細(xì)胞 24、36 h后，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察NaHS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞侵襲的影響。與對(duì)照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組穿膜細(xì)胞數(shù)降低。1 mmol/L組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2、4 mmol/L組與對(duì)照組比較細(xì)胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。1 mmol/L NaHS組細(xì)胞侵襲數(shù)與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3細(xì)胞36 h，細(xì)胞侵襲數(shù)減少，與對(duì)照組比較，能不同程度抑制PC-3細(xì)胞的侵襲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖2。

圖2 NaHS降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞侵襲

2.3 NaHS降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分別作用PC-3細(xì)胞36 h后，ELISA檢測(cè) PC-3細(xì)胞 48 h后上清液中MMP-2、MMP-9表達(dá)變化。與對(duì)照組（0 mmol/L NaHS）相比，各組MMP-2、MMP-9分泌量降低。1 mmol/L組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05），2、4 mmol/L組與對(duì)照組比細(xì)胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。1 mmol/L NaHS組細(xì)胞MMP-2和MMP-9分泌量與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；2、4 mmol/L NaHS作用PC-3細(xì)胞36 h，MMP-2和MMP-9分泌量減少，與對(duì)照組比較，能不同程度抑制PC-3細(xì)胞MMP-2和MMP-9的分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見圖3。

2.4 NaHS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的影響

用0、1、2、4 mmol/L NaHS分別作用PC-3細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)變化。與對(duì)照組（0 mmol/L NaHS）比較，各組Bcl-2 表達(dá)逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)逐漸升高（圖4）。與對(duì)照組（0 mmol/L NaHS）比較，1、2、4 mmol/L NaHS組Bcl-2表達(dá)逐漸降低，Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，呈濃度依賴性（圖4）。

3 討論

硫化氫作為繼一氧化氮、一氧化碳后被發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號(hào)分子，在不需要載體蛋白的情況下，可直接透過細(xì)胞膜，在不同的組織細(xì)胞間有不同的生理濃度，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡起著不同的作用[11]。對(duì)腫瘤細(xì)胞而言，即使是對(duì)同一種腫瘤不同細(xì)胞系，硫化氫的所起的作用亦會(huì)有所用不同：Cao等[12]報(bào)道內(nèi)源性和外源性硫化氫均抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，而Rose等[13]報(bào)道硫化氫抑制HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。

本試驗(yàn)中，2、4 mmol/L NaHS對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的存活率有影響（P＜0.05或P＜0.01），而1 mmol/L NaHS差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：較低濃度（1 mol/L）硫化氫對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有較大影響。較高濃度（2、4 mol/L）硫化氫能抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 NaHS降低前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9

圖4 Western blot檢測(cè)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)變化

通過對(duì)胞漿Bcl-2、Bax蛋白蛋白表達(dá)的檢測(cè)，本文觀察到NaHS能夠降低Bcl-2表達(dá)和促進(jìn)Bax表達(dá)。Bcl-2、Bax基因均屬于Bcl-2家族，分別是Bcl-2家族中最具有代表性的抗凋亡和促凋亡的基因。Bax蛋白主要位于胞漿，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，它從胞漿轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，調(diào)控凋亡誘導(dǎo)蛋白細(xì)胞色素C的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。Bcl-2蛋白位于線粒體膜上，能與Bax蛋白結(jié)合成二聚體，阻止Bax蛋白的釋放，從而抑制細(xì)胞的凋亡[15]。因此，硫化氫可能是通過抑制Bcl-2表達(dá)和促進(jìn)Bax表達(dá)來抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的活性。

腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的、腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的生物學(xué)過程。其中，細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）和血管基膜（basement membrane，BM）的降解是轉(zhuǎn)移多階段過程中的重要步驟?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在該過程中起重要作用，是降解ECM和BM的主要酶類。Brehmer等[16]對(duì)40例PCa切除術(shù)后的標(biāo)本以免疫組化方法檢測(cè)MMP2和MMP-9，結(jié)果表明，與正常前列腺組織相比，MMP-9在腫瘤細(xì)胞和腫瘤內(nèi)及周邊的基質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，MMP-2、MMP-9的表達(dá)隨格里森積分增加有1個(gè)增加的趨勢(shì)。Dong等[17]的實(shí)驗(yàn)研究表明，在前列腺癌細(xì)胞PC-3骨轉(zhuǎn)移組織中，PC-3誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增加以及破骨細(xì)胞募集到骨重塑處，都依賴于MMP-9的表達(dá)。Sauer等[18]對(duì)97例PCa患者血清、活檢組織及前列腺切除術(shù)后的腫瘤組織進(jìn)行MMP-2、MMP-9檢測(cè)。結(jié)果表明，血清中MMP-9表達(dá)顯著增加，且與腫瘤分級(jí)有關(guān)，而MMP-2在前列腺切除術(shù)后的腫瘤組織中，與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度（1 mol/L）硫化氫對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的侵襲沒有較大影響。較高濃度（2、4mol/L）硫化氫作用前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞24 h，能使細(xì)胞的侵襲數(shù)下降，提示較高濃度硫化氫（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞的侵襲，同時(shí)較高濃度硫化氫（2、4 mmol/L）能抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞MMP-2、MMP-9分泌，而較低濃度（1 mol/L）硫化氫對(duì)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞MMP-2、MMP-9分泌無明顯影響。因此，硫化氫可能抑制了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞MMP-2、MMP-9分泌來降低侵襲。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，以非甾體抗炎藥（NSAID）雙氯芬酸和美沙拉秦為母體合成可釋放H2S的衍生物ATB-337和ATB-429[19-20]，釋放硫化氫的非甾體抗炎藥提高其對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗癌作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)硫化氫可能是通過上述機(jī)制來增強(qiáng)非甾體抗炎藥對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗癌作用。因此，隨著對(duì)硫化氫進(jìn)一步研究，從抑制凋亡和侵襲入手，可能為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移治療提供了一條新的途徑。

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