環(huán)境微生物學實驗技術(shù)進展

葉勁松

合肥學院生物與環(huán)境工程系 合肥 230601

環(huán)境微生物學實驗技術(shù)進展

葉勁松

合肥學院生物與環(huán)境工程系 合肥 230601

光學顯微鏡是環(huán)境微生物實驗中進行顯微觀察所必不可少的基本儀器手段。簡介光學顯微鏡的發(fā)展歷程，重點介紹突破光學分辨率技術(shù)的最新光學顯微鏡研制進展；圍繞顯微鏡實驗教學技術(shù)模式，對于最新的數(shù)碼顯微互動系統(tǒng)和對可替代部分真實顯微鏡的虛擬仿真顯微鏡系統(tǒng)進行簡介及展望。

環(huán)境微生物學；實驗技術(shù)；光學顯微鏡

10.3969/j.issn.1671-489X. 2013.18.128

作者：葉勁松，實驗師，研究方向為環(huán)境微生物學。

環(huán)境微生物學是建立在實驗基礎(chǔ)上的操作性很強的一門學科。在環(huán)境微生物學實驗中經(jīng)常使用的儀器為光學顯微鏡和高壓滅菌鍋。其中，光學顯微鏡是進行顯微觀察所最不可少的基本儀器和手段，對于光學顯微鏡尤其是突破其光學分辨率上限的研究一直是熱點。另外，隨著計算機技術(shù)發(fā)展，以顯微鏡為主要工具手段的實驗教學模式技術(shù)也在不斷變革之中，新的教學模式技術(shù)直接推動了顯微鏡實驗教學效果的增強。相對于顯微鏡來說，高壓滅菌鍋除了從手動升級為自動之外，其它并無大的變化。故本文主要從光學顯微鏡發(fā)展及其教學模式技術(shù)革新的視角，對環(huán)境微生物實驗技術(shù)展開綜述。

1 光學顯微鏡的發(fā)展

1.1 光學顯微鏡的研發(fā)歷程

自光學顯微鏡發(fā)明以來，它的每一步發(fā)展都直接推動人類對微觀世界的進一步認識。1590年左右，荷蘭眼鏡商Janssen父子發(fā)明了原始的光學顯微鏡（不超過10倍）。1665年，Robert Hooke用其制造的初具現(xiàn)代光學顯微鏡雛形的顯微鏡，第一次觀測到軟木塞中的“cella”（細胞壁，放大40～140倍）；1680年，荷蘭人Anton van Leeuwenhoek用其制造的約300倍的顯微鏡第一次觀察到細菌和原生動物[1]。

Leeuwenhoek去世后，顯微鏡研究進展緩慢。1752年，英國人J. Dollond發(fā)明消色差顯微鏡。1812年，蘇格蘭人D. Brewster發(fā)明油浸物鏡，并改進了體視顯微鏡。1873年，德國物理學家Ernst Abbe[2]揭示了遠場光學顯微鏡由于光存在衍射效應(yīng)，預言了“阿貝極限”存在，即普通光學顯微鏡分辨力極限約為200 nm[3]。13年后的1886年，Abbe發(fā)明了復消差顯微鏡并改進了油浸物鏡，至此，普通光學顯微鏡技術(shù)基本成熟。1904年后，又先后有熒光顯微鏡、干涉顯微鏡、相位差顯微鏡和Nomarski干涉相位差顯微鏡等特種光學顯微鏡問世[1]。

1984年，第一臺商品化的共聚焦顯微鏡（型號為SOM-100）投入使用。多數(shù)共聚焦顯微鏡所用光源為激光，成像方式為逐點掃描成像，因此又被稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。目前，德國LEICA公司的LEICA TCS SP2顯微鏡分辨率可達到180 nm。

1.2 突破光學分辨率極限的光學顯微鏡

自Abbe后的一個多世紀，200 nm的“阿貝極限”一直被認為是光學顯微鏡理論分辨力極限。此后提高光學分辨率工作一度停滯不前，小于這個尺寸的物體須借助電子顯微鏡或掃描隧道顯微鏡才能觀察。

但是近年來提高分辨率有了較大進展，突破“阿貝極限”的光學顯微鏡相繼問世。在20世紀80年代研發(fā)的近場光學顯微鏡（SNOM，Scanning Near-field Optical Microscope）的出現(xiàn)，是對于普通光學顯微鏡的首次革命。它不用光學透鏡成像而是利用近場光學原理，借鑒掃描隧道顯微鏡（STM）掃描探針技術(shù)，在樣品表面上方掃描獲得表面信息[4]。1984年，瑞士IBM研究中心用金屬鍍膜的石英晶體尖端制成的納米尺寸光孔作為探針，制成世界上第一臺近場光學顯微鏡。同時，美國康乃爾大學用微毛細管拉成溝極細光孔為探針，制成近場光學顯微鏡。從此，近場光學顯微鏡廣泛應(yīng)用于各種微觀觀測領(lǐng)域[5]。目前的近場光學顯微鏡，所報道的分辨率已達λ/20～λ/40[6]。近場光學顯微鏡在納米尺度光學觀察上起到其他掃描探針顯微鏡和原子力顯微鏡所不能取代的作用[7]。

近場光學顯微鏡與傳統(tǒng)光學顯微鏡的最大區(qū)別在于：以納米級光學探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)光學鏡頭；樣品表面近場區(qū)域內(nèi)存在攜帶表面精細結(jié)構(gòu)信息的非輻射場，探針被控制于樣品表面一個波長以內(nèi)的近場區(qū)域內(nèi)，可探測到亞微米級光學信息。這樣就突破了“阿貝極限”的限制，理論上其分辨率是無限大的。NSOM的分辨率不依賴于光的波長，使其成為真正意義上的光學顯微鏡[8]。由于探針尖不能做得無限小和不能無限接近樣品，實際分辨率是有限的[9]。近場光學顯微鏡能克服傳統(tǒng)光學顯微鏡低分辨率以及掃描電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡對生物樣品產(chǎn)生損傷等缺點，且能進行高分辨率光學成像，因此被廣泛應(yīng)用于生物樣品的觀察[10]。

1994年，德國人Stefan Hell巧妙地借助脈沖激光的作用，也突破了“阿貝極限”。他發(fā)明的新型光學顯微鏡STED（受激發(fā)射損耗），分辨率已達到50～70 nm，且理論上還能提高數(shù)倍（據(jù)稱能夠觀察20 nm左右的微小生物）[11]。2011年3月1日，英國和新加坡研究人員報道他們制造出能夠觀測50 nm大小物體的光學顯微鏡，這是迄今觀測能力最強的光學顯微鏡，也是世界上第一個能在普通白光照明下直接觀測納米級物體的光學顯微鏡。而且從理論上說，他們這種基于“透明微米球透鏡”的光學顯微鏡不存在觀測極限。

光學顯微鏡的世界品牌有奧林巴斯、尼康、蔡司和徠卡，這4家公司壟斷了世界高端光學顯微鏡市場，各自擁有自己的獨特技術(shù)。國產(chǎn)顯微鏡中，麥克奧迪是第一品牌，在國外也開始有了一定的知名度，它在顯微數(shù)碼互動方面也有較強的實力；永新光學是第二品牌，包括寧波永新與江南永新；其他品牌還有重慶光電、江西鳳凰光學、桂林光學廠和浙江舜宇等。

2 顯微鏡實驗教學模式技術(shù)的發(fā)展

2.1 傳統(tǒng)顯微鏡實驗教學模式的弊端

傳統(tǒng)顯微鏡教學實驗的方法：每個學生一臺顯微鏡，教師也有一臺顯微鏡；教師以自己的顯微鏡為教具，演示講解顯微鏡如何使用，學生對照老師講解操作自己的顯微鏡。部分學生在使用顯微鏡時總是找不到目標物像，易把瓊脂等異物當作目標，這就需要教師不時走下講臺逐一調(diào)焦找目標。對于實驗結(jié)果如何，教師不能逐一去驗證。此教學模式導致上課秩序較亂，授課教師也疲于奔波，教學效果差。

2.2 數(shù)碼顯微互動系統(tǒng)的顯微鏡教學模式

近年來，數(shù)碼顯微互動系統(tǒng)的出現(xiàn)，是對傳統(tǒng)顯微鏡教學方式具有革命意義的變革，它是伴隨著計算機、通信和多媒體等技術(shù)的發(fā)展出現(xiàn)的。此系統(tǒng)由學生用數(shù)碼顯微鏡、教師用多功能數(shù)碼顯微鏡、軟件平臺、雙向語音交流系統(tǒng)、圖像處理分析系統(tǒng)、多媒體設(shè)備等組成[12]。學生顯微鏡內(nèi)的數(shù)碼信息傳輸?shù)浇處熾娔X上，教師可觀察到每位學生正在觀察的視野，繼而通過投影儀把所有圖像都投射到大屏幕上，可使每位學生在大屏幕上看到自己和其他學生所觀察的圖像。教師只需坐在講臺上，通過耳機和電子呼叫系統(tǒng)給學生做“一對一通話模式”或“一對多通話模式”講授，實現(xiàn)良好的師生互動交流[13]，學生的學習興趣被激發(fā)，教與學的效率也都明顯提高。

國內(nèi)知名顯微鏡廠商麥克奧迪、舜宇及山東易創(chuàng)等，都各自推出自己的顯微互動系統(tǒng)，被許多院校用于形態(tài)學等實驗教學[13-14]和普通微生物實驗教學[15]。

2.3 虛擬仿真顯微鏡技術(shù)的教學模式

如果說數(shù)碼顯微互動系統(tǒng)還需要真實顯微鏡的話，那另外一種剛開始應(yīng)用的、完全不需要顯微鏡的顯微鏡教學技術(shù)手段——顯微鏡虛擬仿真教學，則是對于顯微鏡實驗教學模式的又一次革命，它是伴隨計算機虛擬技術(shù)發(fā)展來的[16]。使用虛擬顯微鏡系統(tǒng)，不必購置昂貴的顯微鏡設(shè)備和易損耗的玻片，能讓學生無任何危險地了解顯微鏡構(gòu)造，又可以讓學生不斷地進行無損練習與反復操作顯微鏡，這有利于對顯微鏡實驗過程的盡快認知與上手[16]。顯微鏡虛擬仿真教學促使從以教師為中心的授課形式變?yōu)橐詫W生為中心的個性化教學，學生由被動聽講變?yōu)橹鲃訉W習，實現(xiàn)了在沒有教師參與情況下自己學習，極大地提高了學生的學習主動性。

目前從事顯微鏡虛擬仿真研發(fā)的公司還很少，它只在一定程度上替代顯微鏡操作而不能完全代替顯微鏡，畢竟實際動手操作的效果要強于任何媒體教學。不過作為一種新型的教學媒體，隨著開發(fā)成本的降低，這種新的技術(shù)必將廣泛應(yīng)用于教學之中，發(fā)揮其特有的先前指導作用。

3 結(jié)語

光學顯微鏡一直在不斷發(fā)展之中，它的每一進步都將直接推動微生物等微觀研究領(lǐng)域?qū)W科的發(fā)展。隨著計算機等行業(yè)的快速發(fā)展，以顯微鏡為工具的實驗教學技術(shù)必將不斷革新，實驗教學效果也將得以不斷優(yōu)化、增強。

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Review of Experiment of Environmental Microbiology

Ye Jinsong

Optical microscopy is the essential and basic tool for microscopic observation in environmental microbiology experiments. The development history of the optical microscope, with focus on the latest progress of technology breakthrough of the optical resolution of optical microscopes was introduced. For illustration of the development of the teaching mode of experiments based on microscopes, the digital microscope mutual system and the latest microscope virtual simulation system that can partly replace real microscope functions were introduced and their applications were expected.

environmental microbiology; experiment; optical microscope

G642.423

B

1671-489X(2013)18-0128-03