中藥專業(yè)研究生培養(yǎng)系列之HPLC含量測定帶教探討

黃月純

中藥專業(yè)研究生培養(yǎng)系列之HPLC含量測定帶教探討

黃月純

（廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣州510405）

中藥專業(yè)研究生培養(yǎng)是醫(yī)院藥學部教學計劃中的組成部分，是培養(yǎng)研究生技能的重要橋梁之一，本文對中藥學研究生培養(yǎng)中最基本、最常用的中藥分析技術HPLC含量測定的帶教培養(yǎng)進行探討。

中藥專業(yè)；碩士研究生培養(yǎng)；高效液相色譜法；帶教

中藥學專業(yè)研究生的培養(yǎng)是大型綜合性醫(yī)院藥學部（藥劑科）教學計劃中的組成部分，是培養(yǎng)研究生技能的重要橋梁之一。高效液相色譜法（HPLC）含量測定是藥物分析最常用的技術，不僅是中藥質(zhì)量研究方向研究生應掌握的技術，也是制劑工藝研究方向研究生應掌握的技術，此外有些從事藥理方向研究生也會涉及到HPLC技術。HPLC含量測定是研究生階段從事質(zhì)量分析研究的基礎，是質(zhì)量標準研究的前提。在大學本科階段，真正掌握了HPLC含量測定方法相關儀器操作、實驗過程操作、方法調(diào)整、數(shù)據(jù)分析處理等技術的學生不多，因此，有必要把HPLC含量測定作為研究生技能培養(yǎng)系列內(nèi)容之一。本文對高效液相色譜儀原理、操作技能、含量測定標準方法解讀及應注意的實驗細節(jié)等方面的帶教培養(yǎng)進行探討，以培養(yǎng)研究生的操作技能以及提高分析和解決實際問題的能力。

1 介紹高效液相色譜儀原理 培訓儀器操作技能

目前國內(nèi)常用的高效液相色譜儀的生產(chǎn)廠家主要有Agilent、Waters、島津、戴安等。檢測器有紫外檢測器（含二極管陣列檢測器）、熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器、質(zhì)譜檢測器等。紫外、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關。不同檢測器原理有較大差異，不同廠家儀器的操作系統(tǒng)亦有不同，而且在本科階段，大多學生只是了解了高效液相色譜儀的基本原理，少有機會進行實際操作。因此，研究生在使用高效液相色譜儀前，應先進行高效液相色譜儀的原理介紹，針對實驗室現(xiàn)有的儀器型號進行操作規(guī)程的介紹、操作技能培訓以及必要的維護等。

2 選擇示范的含量測定標準方法 了解學生對標準方法的掌握程度

2.1 示范的含量測定標準 如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測定［1］。

含量測定參照高效液相色譜法測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21）為流動相；檢測波長為210nm。理論板數(shù)按熊果酸峰計算應不低于5000。

對照品溶液的制備：取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1ml含齊墩果酸50μg，熊果酸0.2mg的混合溶液，即得。

供試品溶液的制備：取本品粗粉約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50ml，稱定重量，超聲

處理（功率250W，頻率50k Hz）30分鐘，放冷，再稱定重量，加乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

本品按干燥品計算，含齊墩果酸（C30H48O3）和熊果酸（C30H48O3）的總量不得少于0.70%。

2.2 了解研究生對方法的掌握程度 針對標準方法，可先讓研究生擬定詳細的實驗步驟，以便了解學生對標準方法的了解及掌握程度。

3 詳細分析含量測定標準項目內(nèi)容及應注意的實驗細節(jié)

雖然標準只規(guī)定了幾行，但包含了較多的信息及要求，需要研究生對標準項目進行深入了解，才能避免實驗出現(xiàn)差錯。

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

3.1.1 適宜型號色譜柱的選擇 高效液相色譜法多采用反相高效液相色譜，標準中一般采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（即C18柱），C18柱的廠家、型號、規(guī)格很多，一般標準未規(guī)定C18柱型號、規(guī)格，可采用進口或國產(chǎn)C18柱。不同C18柱對色譜峰的保留時間往往有較大差異，可通過調(diào)節(jié)流動相比例以達到合適的分離效果。但有些樣品特別是同時測定多種含量的樣品的分離度對色譜柱要求相對較嚴，當分離度達不到要求時，可參考文獻報道方法，選擇合適的色譜柱型號、規(guī)格。如紅參［1］中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的含量測定，采用Zorbax SB C18柱（250×4.6mm，5μm），人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度相對較好。如地黃［1］中梓醇的含量測定，以乙腈-0.1%磷酸溶液（1∶99）為流動相，有機相乙腈所占比例很小，采用一般C18柱進行分析，保留時間太短，如采用全水相柱［如Zorbax SB Aq柱（250×4.6mm，5μm）］則可延長保留時間。在研究生帶教時，應對學生介紹十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的含義，也應簡單介紹C18柱型號、規(guī)格的必要性，同時也要讓學生查詢有關研究的參考文獻，選擇適宜的色譜柱。

3.1.2 檢測波長的固定及參數(shù)的優(yōu)化 檢測波長是HPLC測定最重要的參數(shù)，紫外、熒光、電化學檢測器均規(guī)定了檢測波長。標準規(guī)定的檢測波長固定，不允許更改，但在儀器的一些參數(shù)（帶寬、參比波長、峰寬、狹縫）選擇方面則是應進行優(yōu)化選擇。以Agilent公司儀器為例，使用較寬的帶寬有降低噪聲的優(yōu)點，如使用30nm帶寬比4nm帶寬基線噪聲降低約2.5倍，而信號值是4nm帶寬的75%，一般情況選擇4、8nm帶寬即可；參比波長一般可不選擇，但有些成分分析的基線漂移嚴重（如氨基酸），則使用參比波長對基線有明顯改善；峰寬（響應值）應盡可能接近要測的窄峰峰寬，可選“2s”或“4s”；窄狹縫（如4nm）光譜分辨率高，一般檢測可選用，寬狹縫（如8、16nm）噪音低，當采用末端檢測波長（如203nm）可選用，如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸的含量測定，流動相為乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），檢測波長為210nm，狹縫選擇16nm，基線噪音較?。?］。對于帶寬、參比波長、峰寬、狹縫等要求在標準未注明，需要提醒學生注意。

3.1.3 流動相系統(tǒng)組成的固定及比例的調(diào)整 流動相系統(tǒng)是實驗中容易發(fā)生誤區(qū)的地方，大多學生以為流動相系統(tǒng)比例是固定、不可改變的，拿到標準或參考方法一成不變進行試驗，結果往往不理想，如目標色譜峰的保留時間太短、分離度下降或保留時間太長、峰變寬，理論板數(shù)不符合要求等。因此，在帶教中應向?qū)W生明確標準規(guī)定的流動相系統(tǒng)（如甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸）是固定的，但色譜峰保留時間及分離度易受不同色譜柱、流速、柱溫、室溫、流動相廠家等因素影響，應根據(jù)初試結果，進行流動相比例的調(diào)整。流動相一般為有機相與水相組成，可采用泵的兩個通路；有些為三種組成，如枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸含量測定的乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），可采用泵的三個通路。對于非梯度系統(tǒng)的系統(tǒng)，也可將有機相與水相混合后在一個通路中進行試驗。

3.1.4 流速、柱溫的選擇 一般標準未規(guī)定流速、柱溫，可采用常規(guī)流速1ml／min，柱溫可為室溫10～30℃，有柱溫箱條件的儀器可設定溫度，如25℃、30℃等。

3.1.5 系統(tǒng)適用性試驗的要求 《中國藥典》2010年版附錄ⅥD“高效液相色譜法”項下明確了適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子等四個參數(shù)。在標準中各品種項下一般只規(guī)定了理論板數(shù)，其他參數(shù)參考附錄執(zhí)行，這部分要求往往是學生容易忽視的地方。因此，在HPLC含量測定技能培訓中，應指導學生學習附錄相關要求。對于不同待測成分、不同品種項下某些相同待測成分的理論板數(shù)規(guī)定有差異，應選擇適宜型號的色譜柱及調(diào)整流動相比例使理論板數(shù)符合標準要求。待測峰與相鄰峰的分離度應大于1.5。在系統(tǒng)適用性試驗中的重復性用于評價連續(xù)進樣色譜系統(tǒng)響應值的重復性能。采用外標法時通常取對照品溶液連續(xù)進樣5次，測定峰面積的相對標準偏差應不大于2.0%。拖尾因子用于評價色譜峰的對稱性，在峰高法定量時作要求，而峰面積法測定時，除拖尾嚴重外作出特殊規(guī)定外，一般不作要求。

3.2 對照品溶液的制備 對照品濃度配制準確與否直接影響到含量測定結果，因此在操作前應對學生進行明確說明可能出現(xiàn)及應注意的問題。一般在保存條件良好的對照品按要求配制即可；有些對照品需干燥后取樣（如黃芩項下的黃芩苷對照品應60℃減壓干燥4小時后稱量［1］），應按要求干燥；有些成分（如金銀花項下的綠原酸［1］）遇光容易分解，需配制在棕色瓶中。由于對照品溶液濃度較?。ㄓ行﹥H為10μg／ml），因此應向?qū)W生明確使用的電子天平精度應為十萬分之一。對于配制的濃度應盡可能與標準中規(guī)定的濃度相一致，具體應根據(jù)稱量時的具體重量而定。有些對照品溶解性差（如大黃含量測定項下的大黃素等五種游離蒽醌［1］），必要時應加熱處理或超聲處理使溶解。由于對照品較昂貴，配制的對照

品濃度應注明濃度、配制日期，使用后密閉置冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 供試品溶液的制備 藥材或飲片應按要求粉碎成一定的粉碎度，如粗粉、粉末（過四號篩）等。取樣應精密稱定，宜使用精度為萬分之一的電子天平，至少取樣兩份?？紤]學生操作技能的熟練程度及可能造成的誤差，取樣量三份較適宜。研究生通過本科教育一般基本掌握了樣品的制備方法，容易出現(xiàn)誤差的地方大多對定量操作把握程度不夠，因此，主要針對不足進行稱重、量取、定容等細節(jié)進行技能培訓。另外應對規(guī)定“按干燥品計算”進行補充，除另有規(guī)定外，應取未干燥的供試品進行試驗，并將計算中的取樣量按［檢查］項下測得的水分扣除。

3.4 測定法 標準中要求分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各一定量，注入液相色譜儀，測定對照品溶液及供試品溶液中待測成分的峰面積，按一定的公式計算含量。HPLC法測定含量常采用外標法計算含量。對于進樣量問題，研究生也常有誤區(qū)，認為不可改變，實際上有時應根據(jù)需要進行調(diào)整。如某些型號色譜柱對某些色譜峰分離度不佳，特別是以甲醇-水為流動相系統(tǒng)，供試品溶液以甲醇為溶媒的條件下，常出現(xiàn)前沿峰，理論板數(shù)下降，如青皮項下橙皮苷含量測定規(guī)定進樣量為10μl［1］，改為5μl峰形明顯變得尖銳；有時某些色譜峰（如綠原酸）在進樣量較大（10μl）時出現(xiàn)雙峰，改為5μl則為僅為單峰而且峰形明顯變得尖銳。

4 選擇需要實驗的中藥 讓研究生參與實驗全過程

在進行系列培訓后，選擇需要實驗的內(nèi)容，讓研究生擬定詳細可行的操作步驟，導師檢查后，讓研究生獨立進行實驗的全過程。

本文把HPLC含量測定作為研究生技能培養(yǎng)系列內(nèi)容之一，對中藥學碩士進行了培訓探討，以期有效地提高研究生的實驗操作技能、提高質(zhì)量研究分析能力。

［1］國家藥典委員會．中國藥典（一部）［S］．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：190，143，115，282，205，22，182．

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.21.063

1672-2779（2013）-21-0083-03

楊 杰

2013-07-21）