核酸與死亡時(shí)間的相關(guān)性及其檢測(cè)方法

張志宏，袁雅潔

（廈門市公安局 刑事科學(xué)技術(shù)研究所，福建 廈門361003）

死亡時(shí)間在法醫(yī)學(xué)上是指死后經(jīng)歷時(shí)間或稱死后間隔時(shí)間（postmortem interval，PMI），即發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。死亡時(shí)間推斷即推測(cè)死亡至尸體解剖時(shí)經(jīng)歷或間隔時(shí)間[1]。目前主要根據(jù)尸溫、尸斑、尸僵、角膜改變、胃內(nèi)容物消化程度、膀胱尿量、尸體昆蟲生長(zhǎng)規(guī)律等方法推斷早期和晚期死亡時(shí)間。但是，這些推斷方法受主觀經(jīng)驗(yàn)和客觀條件影響較大，結(jié)果存在一定的誤差，難以滿足法醫(yī)工作復(fù)雜多變的需求。

軀體天然存在的核酸有兩類，一類是脫氧核糖核酸（DNA），存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)；一類是核糖核酸（RNA），存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。軀體死后，組織自溶，DNA降解，直至消失。自然界普遍存在RNA酶，使RNA易發(fā)生降解而不適合推斷死亡時(shí)間，但是，近年來(lái)的研究進(jìn)展表明，mRNA具有一定的穩(wěn)定性，其降解過(guò)程與死亡時(shí)間密切相關(guān)[2]。

隨著分子生物學(xué)檢驗(yàn)手段和計(jì)算機(jī)、光譜等技術(shù)的發(fā)展及其在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用，根據(jù)軀體死后DNA和RNA的降解規(guī)律，測(cè)定組織細(xì)胞的核酸含量推斷死亡時(shí)間，逐漸成為一種新方法。

1 軀體死后DNA和RNA含量的變化規(guī)律

1.1 軀體死后DNA含量的變化規(guī)律

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)軀體死后DNA含量變化做了大量研究，早在1973年Kiliovska等[3]發(fā)現(xiàn)豬死后0～72h內(nèi)，肌肉細(xì)胞核DNA含量隨著PMI的延長(zhǎng)而有規(guī)律下降。1998年Di Nunno等[4]應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)脾組織細(xì)胞DNA含量在死后72h內(nèi)逐漸下降，表明DNA含量與死亡時(shí)間有較強(qiáng)的相關(guān)性；1999年Di Nunno等[5]將上述研究成果應(yīng)用于一起槍殺命案，為法醫(yī)實(shí)踐中推斷死亡時(shí)間提供了一種新方法。1999年王慧君等[6]應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)大鼠死后0～96h的骨骼肌、脾、腎細(xì)胞DNA含量，發(fā)現(xiàn)隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)，各組織細(xì)胞DNA完整片段減少、碎片增多。2000年劉良等[7]相繼報(bào)道了特殊染色結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)大鼠的腦、肝、腎、脾、肺及心肌等細(xì)胞核DNA含量，取得了和上述研究一致的結(jié)果。2005年舒細(xì)記等[8]應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)32例已知死亡時(shí)間的尸體在死后5～36 h腦細(xì)胞DNA含量，發(fā)現(xiàn)人腦細(xì)胞DNA含量隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)有規(guī)律下降。2006年羅光華等[9]應(yīng)用特殊染色結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)研究150例人離體胸骨標(biāo)本DNA降解與腐敗尸體死亡時(shí)間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)胸骨骨髓細(xì)胞核DNA含量隨著死亡時(shí)間延長(zhǎng)呈直線相關(guān)逐漸下降，死后2周DNA含量達(dá)最低值，該方法可以用于晚期死亡時(shí)間推斷。2009年刑浩偉等[10]應(yīng)用改良的Feulgen法結(jié)合計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)檢測(cè)大鼠死后35d內(nèi)肋軟骨細(xì)胞核DNA含量，發(fā)現(xiàn)死后1～28d，細(xì)胞核染色逐漸變淡，至35d時(shí)已觀察不到，該方法可以推斷較長(zhǎng)的晚期死亡時(shí)間。2010年熊平等[11]利用激光共焦顯微拉曼光譜技術(shù)，檢測(cè)人死后不同時(shí)間段腎、肝、脾等組織DNA含量，同樣表明機(jī)體死亡后上述組織細(xì)胞DNA含量隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)呈線性相關(guān)下降趨勢(shì)。

以上研究，雖然檢測(cè)DNA的方法不同，但都得出相同或相近的結(jié)果；即不同的組織器官DNA含量變化與死亡時(shí)間的相關(guān)性有所差別，相同時(shí)間段不同組織器官DNA降解速度有一定差異，但總體而言，DNA含量都隨著死亡時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，并呈一定的線性相關(guān)。

1.2 軀體死后RNA含量的變化規(guī)律

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)mRNA與死亡時(shí)間的相關(guān)性進(jìn)行了許多研究，表明mRNA具有一定的穩(wěn)定性且和死亡時(shí)間相關(guān)[12]。2005年肖俊輝等[13]利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)大鼠死后肺、胸肌β肌動(dòng)蛋白（β-actin）mRNA的表達(dá)水平變化并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)大鼠肺β-actin mRNA于死后12d仍可檢出，胸肌在8d后已無(wú)法檢出，β-actin mRNA在肺臟和胸肌的穩(wěn)定性呈現(xiàn)器官和時(shí)間差異性，可為推斷死亡時(shí)間提供客觀依據(jù)。2007年陳曉瑞等[14]應(yīng)用復(fù)合熒光RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)大鼠死后28h內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞β-actin、Pgk1和Rpl4 mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)管家基因mRNA隨著死亡時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降解。2009年任廣睦等[15]應(yīng)用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)死后不同時(shí)間大鼠腦和脾臟中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA的水平，結(jié)果表明上述管家基因 mRNA的循環(huán)閾值與PMI之間存在顯著的相關(guān)性。2011年王克杰等[16]研究表明小白鼠死后即刻至48h腎組織均可檢測(cè)到GAPDHmRNA和β-actin mRNA，且其擴(kuò)增產(chǎn)物呈規(guī)律性下降趨勢(shì)。

以上研究從半定量到定量對(duì)RNA檢測(cè)逐步深入，一致表明檢測(cè)RNA含量為推斷死亡時(shí)間、尤其是晚期死亡時(shí)間提供了新方法。

2 DNA和RNA含量的檢測(cè)方法

2.1 DNA含量的檢測(cè)方法

2.1.1 改良Feulgen染色和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)

Feulgen染色是DNA特異性染色方法，其基本原理是利用酸解打斷DNA分子鏈中的嘌呤-脫氧核糖鍵，暴露醛基，醛基與schiff染液反應(yīng)生成無(wú)色反應(yīng)物，沖洗脫硫，反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為紅色。應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)獲得積分光密度、平均光度、平均灰度、異型指數(shù)等形態(tài)學(xué)參數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，測(cè)定細(xì)胞核DNA含量，并以此推斷死亡時(shí)間。王成毅等[17]研究表明腦、肝、腎組織中積分光密度和密度變化數(shù)是較好的測(cè)量參數(shù)，肺組織中異型指數(shù)、積分光密度和平均灰度是理想的測(cè)量參數(shù)，脾臟組織的灰度、色度、光密度等參數(shù)與死亡時(shí)間的相關(guān)性較好。

2.1.2 流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）

流式細(xì)胞技術(shù)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)，能準(zhǔn)備地進(jìn)行DNA倍體分析[18]。Di Nunno等[19]應(yīng)用該技術(shù)對(duì)人死后組織細(xì)胞DNA含量進(jìn)行大量研究，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)能準(zhǔn)確、敏感檢測(cè)到隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)DNA含量的變化，并成功應(yīng)用到實(shí)踐當(dāng)中。

2.1.3 單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（single-cell gel eletrophoresis，SCGE）

2002年Johnson使用SCGE檢測(cè)豬死后不同時(shí)間組織細(xì)胞DNA降解情況，并將該技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域推斷死亡時(shí)間[20]。2005年何遠(yuǎn)[21]詳細(xì)報(bào)道了SCGE直接檢測(cè)大鼠死后肝、脾細(xì)胞核DNA降解情況，發(fā)現(xiàn)尾長(zhǎng)、尾距等參數(shù)與死亡時(shí)間高度相關(guān)，建立的回歸方程對(duì)早期死亡時(shí)間的推斷很有優(yōu)勢(shì)。

2.1.4 DNA3’末端轉(zhuǎn)移法（terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT）

2005年張嵐等[22]研究大鼠死后不同時(shí)間肝、腎、脾組織DNA含量變化，應(yīng)用DNA3’末端轉(zhuǎn)移法將dUTP結(jié)合到DNA的3’末端，檢測(cè)反應(yīng)剩余的dUTP量，推測(cè)DNA的降解情況。研究發(fā)現(xiàn)dUTP的剩余量隨死亡時(shí)間延長(zhǎng)而減少，表明該方法檢測(cè)DNA含量可用于早期死亡時(shí)間的推斷。

2.1.5 顯微拉曼光譜技術(shù)（RAMAN）

激光共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域推斷死亡時(shí)間的新方法。拉曼圖譜用散射特征峰的峰位和峰強(qiáng)來(lái)確定，不同生物組織的化學(xué)基團(tuán)都有與之相應(yīng)的散射特征峰，其中1 094cm-1的散射特征峰是DNA骨架磷酸基團(tuán)亞磷酸離子對(duì)稱振動(dòng)帶，代表核酸。每個(gè)散射特征峰的峰強(qiáng)值代表相應(yīng)化學(xué)基團(tuán)在組織中的含量，通過(guò)檢測(cè)樣本的拉曼散射特征峰，觀察其峰位、峰強(qiáng)隨死亡時(shí)間的變化，用相對(duì)峰強(qiáng)比值定量分析組織器官有關(guān)化學(xué)基團(tuán)的變化。2011郭萍等[23]應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)離體人脾組織，發(fā)現(xiàn)48～72h內(nèi)主要散射峰峰位無(wú)明顯變化，而其峰強(qiáng)度有明顯差異；與DNA有關(guān)的峰（1094cm-1）強(qiáng)度隨時(shí)間推移有明顯下降；各相對(duì)峰強(qiáng)（I1094/I2923）隨死亡時(shí)間的推移而減小，該方法較好地反應(yīng)了組織細(xì)胞DNA含量的變化。

2.2 RNA的定量檢測(cè)方法：熒光RT-PCR

熒光標(biāo)記逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)在檢測(cè)mRNA推斷死亡時(shí)間方面，具有靈敏度高、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)。定量PCR選用含量相對(duì)豐富、轉(zhuǎn)錄的RNA較穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參照基因。2009年任廣睦等[15]應(yīng)用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)大鼠死后不同時(shí)間腦、脾等組織器官中管家基因GAPDH mRNA及β-actin mRNA時(shí)序性降解的水平，取得了良好的效果。

3 存在問題和研究前景

檢測(cè)DNA降解和RNA降解的方法不同，故不能對(duì)各自的檢測(cè)數(shù)據(jù)直接對(duì)比，DNA和RNA與死亡時(shí)間的相關(guān)性可以用各自的擬合方程來(lái)衡量，判定系數(shù)越接近于1，擬合方程越理想。不同組織器官死后核酸（DNA和RNA）降解存在差異，尋找理想的組織器官作為研究對(duì)象，是今后研究應(yīng)當(dāng)解決的問題。受諸多因素影響，單一組織器官或單一參數(shù)推斷死亡時(shí)間可靠性較低，結(jié)合DNA和RNA降解規(guī)律，優(yōu)選多個(gè)組織器官、多參數(shù)，將大大提高推斷死亡時(shí)間的準(zhǔn)確性和可靠性。

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和分子生物學(xué)檢測(cè)手段的發(fā)展，其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用使得死亡時(shí)間的研究深入到細(xì)胞分子水平。雖然檢測(cè)核酸推斷死亡時(shí)間的研究還處于實(shí)驗(yàn)階段，但隨著新理論的提出和新檢測(cè)方法的出現(xiàn)，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域會(huì)有廣闊的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

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