23個(gè)STR基因座熒光復(fù)合擴(kuò)增體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評(píng)估

唐建新，李雙琳，劉 宏，翁瑋霞，劉 超，杜蔚安，黃 杰

（1.南方醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)系 廣東 廣州510515；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510080；3無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無錫214174）

復(fù)合STR分型技術(shù)因具有高靈敏度，高鑒別能力以及分型標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)前法醫(yī)學(xué)鑒定的主要技術(shù)。然而，現(xiàn)在廣泛使用的商品化試劑盒主要針對(duì)歐美人群研發(fā)，且在Amelogenin缺失的情況下易導(dǎo)致性別誤判[1]，因此，建立適合我國(guó)人群的復(fù)合擴(kuò)增體系十分必要。本研究新建立的23個(gè)基因座STR復(fù)合擴(kuò)增體系保留CODIS系統(tǒng)中全部基因座，新增PentaD，PentaE，D2S1338，D19S433，D12S391，D2S441，D10S 1248，DYS391，D6S1043九個(gè)基因座，具有良好的兼容性、更高的非父排除率和個(gè)體識(shí)別率。為了評(píng)估該復(fù)合擴(kuò)增體系的適用性，本文就其特異性、同一性、準(zhǔn)確性、均衡性、靈敏度及對(duì)混合樣本、降解檢材、脫落細(xì)胞檢材的分析能力及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 樣本

靈敏度、準(zhǔn)確性、均衡性試驗(yàn)樣本采用標(biāo)準(zhǔn)男性樣本9948。特異性及同一性試驗(yàn)樣本采用狗、貓、豬、牛、雞、鴨、羊、鼠、兔、魚10種常見動(dòng)物血痕30份，來源于科研積累；30例（男、女各15例）同一個(gè)體肌肉組織、血痕、帶毛囊的毛發(fā)樣本，來源于日常檢案積累。案例檢材樣本為脫落細(xì)胞檢材30份，降解檢材30份，Amelogenin基因缺失男性樣本3份，來源于日常檢案積累。男女混合樣本制備方案為：濃度為0.05ng/μL、0.1ng/μL、0.2ng/μL、0.5ng/μL 的 標(biāo) 準(zhǔn) 男 性樣本 9948 分別與濃度為 0.5ng/μL、5.0ng/μL、50ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)女性樣本9947A等體積混合，得到男女DNA比例為 1∶10，1∶5，1∶2.5，1∶1，1∶100，1∶50，1∶25，1∶10，1∶1000，1∶500，1∶250，1∶100 的混合樣本。 群體遺傳學(xué)調(diào)查樣本為196份廣州漢族無關(guān)個(gè)體血痕。

1.2 主要儀器和試劑

EQ1000法醫(yī)提取試劑盒（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），AGCU Expressmarker 23熒光檢測(cè)試劑盒及相應(yīng)的SIZ-500內(nèi)標(biāo)（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）。Freedom EVO全自動(dòng)化工作站平臺(tái)，ABI9700型擴(kuò)增儀，ABI3130XL全自動(dòng)遺傳分析儀

1.3方法

1.3.1 DNA提取

采用基因組Freedom EVO全自動(dòng)化工作站以磁珠法提取基因組DNA，磁珠提取試劑盒為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司的EQ1000法醫(yī)提取試劑盒。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

應(yīng)用25μL標(biāo)準(zhǔn)體系進(jìn)行擴(kuò)增：特異性測(cè)試、同一性測(cè)試、靈敏度測(cè)試、疑難檢材測(cè)試所用體系為：PCR 反應(yīng)液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，templete 1.0μL，sdH2O 8.0μL?；旌蠘颖緶y(cè)試所用體系為：PCR 反應(yīng)液 10.0μL，引物混合液 5.0μL，C-taq 1.0μL，模板 2.0μL，雙蒸水 12.0μL 擴(kuò)增應(yīng)用 ABI9700型擴(kuò)增儀，熱循環(huán)條件： 95℃ 2min；94℃ 30s，60℃ 1min，72℃1min，10 個(gè)循環(huán)； 90℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 10min，20個(gè)循環(huán)。

1.3.3 電泳與分型

取1.0μL PCR產(chǎn)物加入12μL Hi-Di甲酰胺和0.5μL內(nèi)標(biāo)的混合液中，在AB 3130XL遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。使用GeneMapper ID3.2軟件進(jìn)行基因分型。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)

采用powermarkerV3.25計(jì)算雜合度觀察值（H），多態(tài)信息含量（PIC），使用powerstate計(jì)算個(gè)人識(shí)別率（DP），非父排除率（PE）。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度檢測(cè)

25μL體系中，加1μL模板，模板濃度及擴(kuò)增結(jié)果（見圖1）。分型結(jié)果顯示模板濃度在0.05～1.00ng之間時(shí)，擴(kuò)增均衡性、峰高符合要求。

2.2 準(zhǔn)確性及均衡性檢測(cè)

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)男性樣本9948，各基因座等位基因分型準(zhǔn)確，無重疊，無明顯偏離，峰高均在200RFU以上，雜合子兩峰的峰高比例均大于70%，峰值均衡。與商品化試劑盒Sinofiler比較，效果相當(dāng)。

2.3 男女混合樣本檢測(cè)

女性樣本9947A為50ng時(shí)，含0.05ng男性樣本9948的混合樣本檢測(cè)不到AmelY，DYS391；含0.1ng男性樣本9948的混合樣本能檢出男性成分；含0.2ng男性樣本9948的混合樣本能檢出Amel Y（RFU=54），含0.5ng男性樣本9948的混合樣本能檢出Amel Y（RFU=177）及 DYS391（RFU=128）。

圖1 靈敏度測(cè)試分型圖譜

女性樣本9947A為5ng時(shí)，按0.05ng 9948∶5ng 9947混合，9948只能檢測(cè)出 DYS391（RFU98） Amel（RFU95），常染色體檢測(cè)不到；按 0.1ng 9948 ∶5ng9947混合，檢測(cè)出 DYS391（RFU=441）， Amel（RFU=297），常染色體檢測(cè)不到；按0.2ng9948∶5ng9947混合及0.5ng 9948∶5ng9947，9948時(shí)，能檢出為混合樣品。

女性樣本9947A為0.5ng時(shí)，所有混合樣品均能檢測(cè)出男性成分。

2.4 特異性、同一性檢測(cè)

對(duì)狗、貓、豬、牛、雞、鴨、羊、鼠、兔、魚 10 種常見動(dòng)物血痕DNA復(fù)合擴(kuò)增后，均未檢見特異分型。檢測(cè)已知同一男性個(gè)體肌肉組織、血痕、帶毛囊的毛發(fā)，均獲得完整分型，無等位基因丟失及分型錯(cuò)誤。

2.5 案例檢材檢測(cè)

對(duì)脫落細(xì)胞檢材30份，降解檢材30份進(jìn)行分型，結(jié)果表明所有分型與Sinofiler分型結(jié)果一致（見圖2～3）。

圖2 脫落細(xì)胞檢材EX23復(fù)合擴(kuò)增體系STR分型

圖3 降解檢材EX23復(fù)合擴(kuò)增體系STR分型

2.6 缺少牙釉基因的男性樣本檢測(cè)

檢測(cè)3例Amel Y丟失的男性樣本。使用EX23進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后結(jié)果顯示Amel Y未檢測(cè)出分型，DYS391均成功分型。

2.7 多態(tài)性檢測(cè)

對(duì)廣東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體血痕196份進(jìn)行DNA分型，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示除性別判斷位點(diǎn)以外基因座的基因型分布符合H-W平衡（P＞0.01），雜合度觀察值（H）在0.658～0.898 之間，多態(tài)信息含量（PIC）在 0.378～0.865之間，累計(jì)個(gè)人識(shí)別（TDP）率達(dá)0.999999999，三聯(lián)體累計(jì)非父排除率（CPE）達(dá)0.999999997。

表1 廣東漢族人群23個(gè)STR基因座的法醫(yī)學(xué)參數(shù)

3 討論

在不同的地區(qū)和人群，STR基因座頻率具有明顯的差異[2]，因此不同的STR基因座往往被選擇性地使用[3]。最近，美國(guó)FBI對(duì)13個(gè)CODIS基因座重新進(jìn)行了評(píng)估，并最終確立了含20個(gè)STR基因座的擴(kuò)展核心基因座[4-5]。

本文采用的復(fù)合擴(kuò)增體系與以往的試劑盒相比，一個(gè)明顯變化是在常染色體位點(diǎn)中新增了DYS391基因座用以輔助判斷性別、提高分辨能力?，F(xiàn)在廣泛使用的商品化試劑盒均借助Amelogenin基因判斷性別。通常AMELX的丟失變異不會(huì)導(dǎo)致性別的錯(cuò)判，而AMELY染色體的片段缺失、引物結(jié)合區(qū)的突變均將導(dǎo)致性別判斷錯(cuò)誤[6]。不同人群AMELY分型失敗的頻率差異較大，最高的是斯里蘭卡，為8.3%，最低為意大利，僅0.008%[7]。中國(guó)男性群體中AMELY分型失敗率為0.085%，可能的原因?yàn)閅p11.2的缺失而非引物結(jié)合區(qū)突變，且這種缺失無規(guī)可循[8]。為了避免性別錯(cuò)判，新試劑盒增加DYS391后，可以有效避免Amel Y丟失造成的性別誤判。此外，對(duì)該復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行靈敏度檢測(cè)時(shí)，當(dāng)模版量為0.03ng時(shí)，雖然可檢出全部基因座，但均衡性較差，D3S1338的雜峰干擾結(jié)果判讀。因此，使用該復(fù)合擴(kuò)增體系檢測(cè)極微量檢材時(shí)，應(yīng)留意雜峰的干擾。

綜上所述，本文采用的23位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增體系在常染色體位點(diǎn)中加入了Y染色體位點(diǎn)，提高了性別判斷的準(zhǔn)確性，與以往單純依靠Amelogenin基因相比具有很大的改進(jìn)；在體系檢測(cè)中，各項(xiàng)性能指標(biāo)均符合法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的需要，可以應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)實(shí)踐。

[1]Turrina S，F(xiàn)ilippini G，Voglino G，etal.Two additional reports of deletion on the short arm of the Y chromosome.Forensic Sci Int Genet[J].2011，（3）：242-246.

[2]劉長(zhǎng)暉，劉超，楊電，等.廣州地區(qū)人群15個(gè)STR基因座遺傳多態(tài)性[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2007，22（5）：327-329.

[3]Gill P， Fereday L， Morling N，etal.The evolution of DNA databases--recommendations for new European STR loci[J].Forensic Sci Int， 2006，156（2-3）：242-244.

[4]J.M.Butler，C.R.Hill.Biology and genetics of new autosomal STR loci useful for Forensic DNA analysis[J].Forensic Science Review，2012，24（1）：16-26.

[5]Hares，D.R.Expanding the CODIS core loci in the United States[J].Forensic Sci Int Genet， 2012， 6（1）：e52-e54.

[6]Karl Zehethofer，Burkhard Rolf.A molecular analysis of three amelogenin negative males in two routine paternity test[J].Forensic Sci Int Genet， 2011，5（5）：550-551.

[7]Takayama T，Takada N，Suzuki R，etal.Determination of deleted regions from Yp11.2 of an amelogenin negative male[J].Legal medicine，2009，11（SUPPL.1）：S578-S580.

[8]陳愛萍，陳勇，王會(huì)品，等.中國(guó)人群Amelogenin基因的突變頻率和突變類型[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2007，24（6）：615-619.