蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在擠壓過程中的變化

房巖強(qiáng) 魏益民 張 波

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

蛋白質(zhì)的螺桿擠壓過程通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果［1］。在機(jī)械能和熱能的作用下，蛋白質(zhì)分子維持高級結(jié)構(gòu)的非共價(jià)鍵被破壞，分子逐漸展開呈鏈狀結(jié)構(gòu)，并順著物料運(yùn)動方向取向［1－3］。在取向過程中，蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子或其他分子之間再隨機(jī)發(fā)生各種化學(xué)作用?；瘜W(xué)作用主要可能發(fā)生在分子側(cè)鏈之間，其結(jié)果是形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并呈現(xiàn)出各向異性，即在平行于運(yùn)動方向的強(qiáng)度較大，而垂直于運(yùn)動方向的強(qiáng)度較弱［4－6］。由于體系中蛋白質(zhì)分子較多，因此蛋白質(zhì)分子間作用形成的聚合體可能是骨架，其他分子則填充在骨架之間［7］。

研究和明確螺桿擠壓過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的變化，可為控制擠壓過程中蛋白質(zhì)的變性提供理論依據(jù)，從而有利于改進(jìn)擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝和提高產(chǎn)品質(zhì)量。另外，通過擠壓過程中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)變化的研究對于闡明擠壓組織化蛋白產(chǎn)品的形成機(jī)理具有指導(dǎo)意義。本文從蛋白質(zhì)組分、分子質(zhì)量、共價(jià)鍵以及二級結(jié)構(gòu)等方面總結(jié)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在螺桿擠壓過程中的變化。

1 蛋白質(zhì)的組分及分子質(zhì)量的變化

植物蛋白，如大豆蛋白、小麥蛋白、花生蛋白等是擠壓組織化蛋白生產(chǎn)的主要原料。植物蛋白依據(jù)其溶解性，可分為清蛋白（albumin）、球蛋白（globulin）、醇溶蛋白（prolamin）、谷蛋白（glutenin）和殘?jiān)鞍祝╮esidue）［8］。擠壓過程中，蛋白質(zhì)分子變性，溶解性等理化特性發(fā)生變化，表現(xiàn)出蛋白質(zhì)組分比例的變化。對于擠壓后蛋白質(zhì)組分及分子質(zhì)量的變化，研究者一方面比較關(guān)注擠出蛋白的組分及分子質(zhì)量分布；另一方面，研究者比較關(guān)注的是不同蛋白質(zhì)組分與擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的關(guān)系。

不同擠壓原料，5種蛋白質(zhì)組分含量有所不同，如小麥蛋白主要以谷蛋白和醇溶蛋白為主，而大豆蛋白主要以球蛋白為主。目前，大多數(shù)研究表明，擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，而殘?jiān)鞍缀匡@著增加。Gujska等［9］采用Osborne的蛋白質(zhì)組分提取方法，對不同溫度（110、135、150℃）擠壓后的菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，各種溫度擠壓處理后，菜豆和斑豆中的清蛋白和球蛋白含量都顯著降低，而殘?jiān)鞍缀烤@著增加。擠壓后菜豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了59%～84%和70%～93%，而殘?jiān)鞍自黾恿?21%～288%。斑豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了77%～80%和92%～94%，而殘?jiān)鞍自黾恿?53%～264%。Alonso等［10］對擠壓前后豌豆和四季豆中清蛋白和球蛋白的含量進(jìn)行了類似研究，結(jié)果表明，擠壓后豌豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了41%和78%，而殘?jiān)鞍自黾恿?26%。四季豆中的清蛋白和球蛋白分別降低了64%和85%，而殘?jiān)鞍自黾恿?24%。Li等［11］通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）對小麥蛋白擠壓前后的組分分布進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，擠壓后麥谷蛋白和麥醇溶蛋白含量顯著降低，殘?jiān)鞍罪@著增加。

擠壓過程中，蛋白質(zhì)組分的變化與不同組分氨基酸的組成有較為密切的關(guān)系。清蛋白和球蛋白大多是生理活性蛋白質(zhì)，含較多的賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸；醇溶性蛋白和谷蛋白是貯藏性蛋白，脯氨酸和谷氨酰胺含量較高，賴氨酸、色氨酸和蛋氨酸含量較低。Li等［11］發(fā)現(xiàn)，小麥蛋白擠壓過程中，分子質(zhì)量位于45～66 ku的麥醇溶蛋白受高溫?cái)D壓影響較小，認(rèn)為可能是由于這部分麥醇溶蛋白所含疏水性氨基酸或半胱氨酸較少，擠壓過程中，它們不能通過疏水作用或二硫鍵發(fā)生聚合。Fischer［12］對小麥蛋白擠出物研究后也有類似發(fā)現(xiàn)。Fischer的結(jié)果表明，麥醇溶蛋白與蛋白質(zhì)網(wǎng)的形成高度相關(guān)，但不同種類麥醇溶蛋白與其的密切程度不同。擠壓產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成主要與α－麥醇溶蛋白和γ－麥醇溶蛋白有關(guān)，與ω－麥醇溶蛋白關(guān)系較小。這是由于ω－麥醇溶蛋白缺少巰基基團(tuán)，不能通過二硫鍵發(fā)生聚合。但Fischer又認(rèn)為ω－麥醇溶蛋白仍可能通過非二硫鍵的聚合對蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成發(fā)揮一定作用。

螺桿擠壓過程中，分子質(zhì)量變化是導(dǎo)致蛋白質(zhì)理化特性改變的重要原因，例如分子質(zhì)量或分子尺寸的增加往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解性的降低［11］。擠壓過程中既有蛋白質(zhì)的降解，又有蛋白質(zhì)的聚合［12－14］，因此，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的變化較為復(fù)雜。對于擠壓過程中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變化的研究，目前多采用聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳法，考察蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量分布的變化。對于蛋白質(zhì)真實(shí)分子質(zhì)量變化的研究還很有限［15］。

Alonso等［10］通過 SDS－PAGE對豌豆和腰豆擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后，豌豆原有的 75、50、38、25、22 ku的電泳條帶變得模糊，而新出現(xiàn)了34、14 ku的蛋白片段；腰豆原有的45、31 ku的電泳條帶消失，新生成了分子質(zhì)量為14～22 ku的蛋白片段［6］。Chiang［16］通過 SDS－PAGE對大豆擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后大豆原有的42 ku的7S球蛋白亞基消失，而34～44 ku11S球蛋白亞基的含量顯著增加。陳鋒亮［17］對大豆蛋白擠出物的亞基條帶分析后，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白 7S／11S的亞基比例顯著降低。Anderson等［13］通過SDS－PAGE對小麥蛋白擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后蛋白質(zhì)的亞基分布呈現(xiàn)出由高分子質(zhì)量向低分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢。徐樹來［18］通過SDS－PAGE對米糠蛋白擠壓前后的蛋白質(zhì)片段進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓后米糠蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量整體降低。

擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，殘?jiān)鞍缀匡@著增加。但擠壓處理對ω－麥醇溶蛋白等不含硫氨基酸片段影響較小。擠壓后，蛋白質(zhì)的亞基分子質(zhì)量分布呈現(xiàn)出向小分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢，這可能是由于蛋白質(zhì)分子受到高溫和剪切力的作用后，各亞基產(chǎn)生分離引起的［19］。

2 蛋白質(zhì)共價(jià)鍵的變化

螺桿擠壓破壞了蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子或其他分子之間舊的化學(xué)鍵和相互作用，并通過形成新的化學(xué)交聯(lián)，使得肉類似物得以形成。肽鍵和二硫鍵是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)維持中的主要共價(jià)鍵。它們也是擠壓過程中蛋白質(zhì)分子作用力變化的重要研究對象。

擠壓過程中是否有異肽鍵的形成，即維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的作用力中是否有異肽鍵一直是研究者爭議的焦點(diǎn)。Burgess等［20］認(rèn)為，擠壓過程中，大豆蛋白分子間有新的肽鍵（異肽鍵）形成，新形成的異肽鍵是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的最主要化學(xué)鍵，而二硫鍵的作用可以忽略。Hager［21］以大豆?jié)饪s蛋白為原料，對維持組織化產(chǎn)品化學(xué)作用力的主要類型進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，擠壓過程中沒有異肽鍵的生成，疏水作用、氫鍵和分子間二硫鍵是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的三種主要化學(xué)作用。這與Burgess等的結(jié)論截然相反。Hager認(rèn)為，這可能是由于擠壓溫度不同所致。Burgess等采用的擠壓溫度為150～190℃，而Hager采用的最高溫度僅有150℃。后來，Prudêncio－Ferreira等［22］系統(tǒng)研究了擠壓溫度（140～180℃）對蛋白質(zhì)分子作用力的影響。結(jié)果表明，二硫鍵和非共價(jià)鍵作用是維持?jǐn)D壓產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的主要作用力，即使180℃條件下擠壓后，維持組織化產(chǎn)品的作用力中也沒有異肽鍵。當(dāng)前大多數(shù)研究表明，組織化產(chǎn)品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的維持主要通過二硫鍵和非共價(jià)鍵作用，而沒有異肽鍵的參與［23－26］。

自由巰基和二硫鍵含量變化的研究是探討二硫鍵作用的重要途徑。Burgess等［20］對大豆?jié)饪s蛋白擠壓前后自由巰基和二硫鍵含量測定后發(fā)現(xiàn)，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由4．5×10－8mol／mg降至0．9×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 3．3×10－8mol／mg升高到 48．9×10－8mol／mg。因此，他們認(rèn)為擠壓會嚴(yán)重破壞二硫鍵的形成。Hager［21］在水分為27%擠壓溫度140℃條件下考察了擠壓對大豆分離蛋白自由巰基和二硫鍵含量的影響。結(jié)果表明，擠壓后大豆蛋白的二硫鍵濃度由22．7×10－8mol／mg降至19．6×10－8mol／mg，而自由巰基濃度由 0．5×10－8mol／mg升高到4．1×10－8mol／mg。當(dāng)前，大部分研究結(jié)果與他們的研究基本一致。即擠壓處理對二硫鍵有破壞作用，并引起自由巰基含量的增加［11，13，22］。

擠壓溫度是影響蛋白質(zhì)自由巰基和二硫鍵含量的重要因素［22，27－28］。Prudêncio－Ferreira等［22］分別對140、160、180℃擠壓處理后大豆分離蛋白擠出物中自由巰基和二硫鍵的含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，140℃擠出物中的二硫鍵含量與原料相比基本沒有變化（增加了0．2%），160、180℃擠出物中二硫鍵的含量相比原料分別降低了17%和25%；自由巰基含量在各溫度處理后相比原料都有顯著增加，分別增加了42%、76%和 122%。Fischer［12］分別對 140、160、180℃擠壓處理后小麥蛋白擠出物中自由巰基的含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，自由巰基含量在各溫度處理后都有顯著增加，分別增加了107%、113%和348%。Rebello等［29］分別對160、185℃小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，擠壓溫度對小麥蛋白擠出物中的二硫鍵含量具有負(fù)影響。張汆［27］分別對 100、120、140、145、150、155℃擠壓處理后花生蛋白擠出物中的二硫鍵含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，當(dāng)擠壓溫度低于150℃時(shí)，擠出物中的二硫鍵含量相比原料基本沒有變化，但155℃擠壓處理后，擠出物中二硫鍵含量相比原料顯著降低?？梢?，擠壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響，特別是當(dāng)擠壓溫度大于160℃時(shí)，溫度對自由巰基和二硫鍵含量變化的影響更為明顯。

擠壓過程中，自由巰基和二硫鍵含量的變化同時(shí)受到水分含量的影響。Prudêncio－Ferreira等［22］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水分由30%升至40%時(shí)，大豆分離蛋白擠出物中自由巰基含量由 5．42×10－10mol／mg降低至4．37×10－10mol／mg，二硫鍵含量由249．9×10－10mol／mg升高至278．0×10－10mol／mg。表明水分含量對二硫鍵有正影響，對自由巰基有負(fù)影響。Fischer［12］以小麥蛋白為原料也進(jìn)行了水分含量對自由巰基含量影響的研究。結(jié)果也表明，水分含量對自由巰基有負(fù)影響。當(dāng)水分由20%升至24%時(shí)，擠出物中自由巰基含量由 11．82×10－9mol／mg降低至 4．59×10－9mol／mg。

擠壓過程中，機(jī)械剪切也是影響自由巰基和二硫鍵含量的重要因素。理論上分析，機(jī)械剪切對二硫鍵的形成具有相反的兩方面作用。一方面，機(jī)械剪切可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子更多的巰基基團(tuán)暴露；在氧氣的參與下，巰基基團(tuán)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而促進(jìn)二硫鍵的形成。另一方面，機(jī)械剪切憑借物理剪切作用，打斷蛋白質(zhì)分子之間的二硫鍵，降低二硫鍵的含量［30－31］。因此，機(jī)械剪切對自由巰基和二硫鍵含量的影響會因機(jī)械剪切強(qiáng)度的不同而產(chǎn)生差異。Fischer［12］發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單位機(jī)械能耗（SME）由 32．1 Wh／kg升至41．1 Wh／kg時(shí)，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由 20．54×10－9mol／mg降 低 至 8．68×10－9mol／mg。Rebello等［29］發(fā)現(xiàn)，當(dāng) SME由 302 kJ／kg升至656 kJ／kg時(shí)，小麥蛋白擠出物中自由巰基含量由7．7×10－9mol／mg升高至 21．6×10－9mol／mg，而二硫鍵濃度由51．5×10－9mol／mg降低至 43．1×10－9mol／mg。

擠壓過程中沒有異肽鍵產(chǎn)生。擠壓過程中，擠壓溫度、水分含量和機(jī)械剪切強(qiáng)度對二硫鍵的形成都具有重要影響。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響；當(dāng)擠壓溫度大于160℃時(shí)，自由巰基和二硫鍵含量的變化更顯著。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負(fù)影響。

3 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助氫鍵作用排列成為沿一個(gè)方向、具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，以α－螺旋、β－折疊、β－轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲最為常見［32］。擠壓過程中，蛋白質(zhì)分子去折疊化，相對線性化，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞。其研究焦點(diǎn)在于擠壓后蛋白質(zhì)的有序二級結(jié)構(gòu)是否完全喪失，即破壞的程度。

Yuryev等［33］較早通過紅外光譜技術(shù)對大豆分離蛋白擠出物構(gòu)象進(jìn)行了觀察。結(jié)果表明，擠壓后，蛋白質(zhì) β－折疊結(jié)構(gòu)含量增加。Prudêncio－Ferreira等［22］對不同溫度（140、160、180℃）和水分含量（30%和40%）條件下大豆分離蛋白擠出物進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果表明，所有擠出物中都含有β－折疊結(jié)構(gòu)。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，分別對120、140、160℃條件下大豆蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行了紅外光譜分析。結(jié)果也表明，擠壓后，大豆蛋白沒有完全線性化，或完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，一定的有序結(jié)構(gòu)（β－折疊和β－轉(zhuǎn)角）仍被保留。但 Qi等［34］以圓二色光譜對不同溫度（50、75、100℃）和水分條件（20%～50%）下乳清分離蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)研究后發(fā)現(xiàn)，50℃的擠出物與原料相比，二級結(jié)構(gòu)基本沒有變化；當(dāng)溫度升至75℃，蛋白質(zhì)有序二級結(jié)構(gòu)的含量開始顯著降低；當(dāng)溫度達(dá)100℃時(shí)，蛋白質(zhì)已只剩下無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；表明擠壓溫度對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響顯著。有研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同水分條件下所得擠出物的二級結(jié)構(gòu)基本沒有變化，表明水分含量對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)影響較?。?0］。陳鋒亮［17］以紅外光譜對不同擠壓溫度（140、150、160℃）和含水量（28%～60%）條件下大豆分離蛋白擠出物的二級結(jié)構(gòu)研究后也有類似發(fā)現(xiàn)，即擠壓溫度對α－螺旋和β－轉(zhuǎn)角的含量具有顯著的負(fù)影響，對β－折疊的含量具有顯著的正影響，而對無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量沒有顯著影響。物料水分對蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)的變化影響較小。但物料水分與擠壓溫度存在顯著的交互作用，并對β－轉(zhuǎn)角的含量產(chǎn)生極顯著負(fù)影響。

擠壓過程中，機(jī)械剪切對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)也有一定影響。魏益民等［19］以低溫脫脂豆粕為原料，系統(tǒng)研究了螺桿轉(zhuǎn)速對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)螺桿轉(zhuǎn)速由60 r／min升高至180 r／min時(shí)，大豆蛋白β－折疊質(zhì)量分?jǐn)?shù)由55．6%降低至46．7%，而β－轉(zhuǎn)角質(zhì)量分?jǐn)?shù)由44．4%升高至53．5%。

可見，擠壓過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化受擠壓溫度影響較大。當(dāng)溫度高于某一臨界值時(shí)，蛋白質(zhì)的有序二級結(jié)構(gòu)開始完全喪失。此臨界值的高低因擠壓原料的不同而存在較大差異。對于植物蛋白，此臨界溫度高于180℃。水分含量對二級結(jié)構(gòu)的變化沒有顯著影響。螺桿轉(zhuǎn)速對β－折疊具有負(fù)影響，而對β－轉(zhuǎn)角具有正影響。

4 結(jié)論

螺桿擠壓后，原料中的主要蛋白質(zhì)組分含量顯著降低，殘?jiān)鞍缀匡@著增加。擠壓后，蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量分布呈現(xiàn)出向小分子質(zhì)量轉(zhuǎn)變的趨勢。

擠壓過程中沒有異肽鍵的形成。擠壓溫度對二硫鍵含量具有負(fù)影響，對自由巰基含量具有正影響。當(dāng)擠壓溫度大于160℃時(shí)，溫度對自由巰基和二硫鍵含量的影響更明顯。水分含量對二硫鍵含量有正影響，對自由巰基含量有負(fù)影響。

擠壓會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角等有序二級結(jié)構(gòu)含量降低。當(dāng)擠壓溫度低于180℃時(shí)，植物蛋白不會完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。水分含量對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化沒有顯著影響。螺桿轉(zhuǎn)速對β－折疊具有負(fù)影響，對β－轉(zhuǎn)角具有正影響。

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