Krüppel樣因子4基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

馬國燕 盧 靜 (邯鄲市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 邯鄲 056001)

Krüppel樣因子(KLFs)家族屬于真核生物中含鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族成員在多種細(xì)胞系中均有表達(dá)，主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控。Krüppel樣因子4(KLF4)是KLF家族中研究較多的成員之一。隨著對(duì)KLF4研究的不斷深入，該蛋白的生物學(xué)功能以及與腫瘤、心血管疾病等老年人?；技膊〉年P(guān)系已經(jīng)逐漸明確。由于KLF4蛋白在眾多疾病中均有重要作用，本文對(duì)KLF4基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 KLF4的結(jié)構(gòu)及功能特征

KLF4又稱胃腸富集Krüppel樣因子(GKLF)或表皮鋅指因子(EZF)。該蛋白常見表達(dá)于胃腸道上皮，并由Yet等〔1〕在1998年首次克隆出人的KLF4基因。KLF4的羧基末端具有一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，含有3個(gè)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，由81個(gè)高度保守的氨基酸形成，與GC盒或CACCC元件有高度的親和性，主要識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)富含GC的DNA序列〔2〕。在KLF4氨基端含有高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，在91～117位氨基酸殘基之間含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸和絲氨酸，而在181～388位氨基酸殘基之間存在轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸，表明KLF4具有激活基因轉(zhuǎn)錄和抑制基因轉(zhuǎn)錄兩種方式，并發(fā)揮不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。

2 KLF4的組織分布及功能

在胚胎發(fā)育過程中KLF4到胚胎發(fā)育的后期才有較高的表達(dá)水平。在成熟的組織中，KLF4主要在消化道、口腔、食管上皮、皮膚表皮、血管內(nèi)皮及胸腺上皮中表達(dá)〔3，4〕。在上皮的各層中，KLF4在上層分化細(xì)胞中表達(dá)較高，而在基底層生長(zhǎng)迅速的細(xì)胞中表達(dá)很低。在收縮表型(分化型)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中KLF4通常不表達(dá)〔5〕，但血管受到損傷后，VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，KLF4表達(dá)水平會(huì)迅速升高〔6〕。

VSMC的表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管再狹窄等血管重塑性疾病的主要細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。KLF4在VSMC表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了重要的作用。KLF4通過與VSMC分化標(biāo)志基因的啟動(dòng)子結(jié)合而激活分化標(biāo)志基因的表達(dá)，抑制去分化標(biāo)志基因SMemb的表達(dá)，參與了ATRA誘導(dǎo)VSMC的分化。KLF4能結(jié)合于SMα-actin以及SM22α基因啟動(dòng)子的TCE元件，抑制TGF-β1對(duì)VSMC分化標(biāo)志基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用〔7〕。

KLF4通過使細(xì)胞周期停滯在G1/S和G2/M期抑制細(xì)胞的增殖〔8〕。KLF4 通過 p53 抑制 VSMC 增殖〔9〕。KLF4 可與p21WAF1/Cip1基因啟動(dòng)子上富含GC的特異的順式作用元件作用，反式激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p21WAF1/Cip1蛋白，上調(diào)該蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期受到阻止，抑制細(xì)胞增殖〔10〕。相反，KLF4 又可抑制細(xì)胞周期蛋白 cyclinB1〔11〕和 cyclinD1〔12〕基因的啟動(dòng)子，下調(diào)cyclinB1與cyclinD1蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

KLF4在細(xì)胞的增殖及分化中發(fā)揮著重要的作用。KLF4在皮膚癌、T細(xì)胞白血病、食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、膀胱癌以及宮頸癌等多種腫瘤〔13～16〕中表達(dá)下調(diào)。過表達(dá)KLF4可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，明顯減少人類結(jié)腸癌的發(fā)生〔17〕。但是在發(fā)育異常的口腔上皮、鱗狀細(xì)胞癌及大多數(shù)乳腺癌中KLF4基因呈高表達(dá)狀態(tài)〔18〕，這表明KLF4既可以表現(xiàn)為抑癌基因也可以表現(xiàn)為癌基因。

3 各種因素調(diào)控KLF4的表達(dá)

目前對(duì)KLF4調(diào)控靶基因的研究較多，已證實(shí)的可被KLF4激活的有 p21WAF1/Cip1、γ球蛋白、CD24及角蛋白 4和9〔19～22〕等基因的啟動(dòng)子，可被 KLF4 抑制的有 β 球蛋白〔22〕、cyclinD1、cyclinB1、細(xì)胞色素 P450〔23〕及 p53〔24〕等。而對(duì) KLF4 基因自身的表達(dá)調(diào)控以及相關(guān)的信號(hào)通路研究尚少，但是通過對(duì)GKLF基因上游的調(diào)控序列分析，發(fā)現(xiàn)它含有Sp1、AP1、CDX、GATA、USF等多種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)和KLF4自身的順式作用元件，提示這些轉(zhuǎn)錄因子可能調(diào)控KLF4的表達(dá)，但是盡管KLF4啟動(dòng)子上也存在很多GATA蛋白的順式作用元件，但是GATA因子對(duì)GKLF啟動(dòng)子沒有影響〔23〕。

3.1 KLF4參與自我調(diào)控 KLF4基因的典型的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是在其5'端附近富含GC的DNA序列，而KLF4含有鋅指結(jié)構(gòu)，主要與DNA的CACCC元件結(jié)合，能夠識(shí)別和結(jié)合富含GC的序列，所以能夠直接和自身基因的TATA盒5'末端的三個(gè)GC盒相互作用，從而序列特異性地反式激活自身的啟動(dòng)子，作為順式作用元件調(diào)節(jié)自身的轉(zhuǎn)錄，KLF4能夠和這三個(gè)GC盒結(jié)合，突變一個(gè)或多個(gè)GC盒位點(diǎn)都會(huì)導(dǎo)致KLF4反式激活啟動(dòng)子的能力降低〔24〕。

3.2 KLF4與KLF5對(duì)KLF4基因啟動(dòng)子的相反作用 KLF4和KLF5是Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子KLFs家族中密切相關(guān)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，均在小腸上皮表達(dá)，KLF4主要在終末分化的絨毛細(xì)胞中表達(dá)，而KLF5主要在增生的隱窩細(xì)胞中表達(dá)，表現(xiàn)相反的生物學(xué)效應(yīng)。Dang等〔25〕人的研究證實(shí)，在KLF4基因的啟動(dòng)子區(qū)含有KLF4和KLF5的結(jié)合位點(diǎn)，二者都能夠與同一個(gè)順式作用元件CACCC結(jié)合，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于此位點(diǎn)。KLF4和KLF5在對(duì)KLF4的表達(dá)上有相反的生物學(xué)功能，KLF4激活其自身啟動(dòng)子的活性，KLF5抑制KLF4基因啟動(dòng)子的活性〔25〕。KLF4和KLF5在組織的表達(dá)分布和對(duì)KLF4啟動(dòng)子活性的對(duì)立影響，為二者協(xié)調(diào)參與胃腸上皮細(xì)胞的增殖和分化提供了基礎(chǔ)〔25〕。

3.3 KLF4在人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO中的表達(dá)依賴于CDX2結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因可以誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)〔26〕，在家族性多發(fā)性腺瘤(FAP)患者，由于抑癌基因APC的功能丟失，導(dǎo)致KLF4的表達(dá)明顯下調(diào)。尾型同源核轉(zhuǎn)錄因子CDX-2是腸道上皮特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的CDX2表達(dá)能夠延遲細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞分化。在KLF4啟動(dòng)子上有一個(gè)CDX2的結(jié)合位點(diǎn)，CDX2可以反式激活KLF4啟動(dòng)子。但是野生型的CDX2能夠激活KLF4啟動(dòng)子，而突變的CDX2抑制野生型CDX-2對(duì)KLF4啟動(dòng)子的活化，表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)〔27〕。在幾種人結(jié)腸癌細(xì)胞系中，RKO細(xì)胞中的KLF4表達(dá)最低，因?yàn)镽KO細(xì)胞有一個(gè)CDX2的突變等位基因，導(dǎo)致蛋白羧基端讀框移位。通過對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腺瘤性息肉病(APC)基因誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)需要依賴CDX2激活KLF4的啟動(dòng)子〔27〕。

3.4 PDGF-BB誘導(dǎo)平滑肌的表型轉(zhuǎn)化過程中SP1活化KLF4血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)可刺激VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。PDGF-BB可誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)，在VSMC分化中發(fā)揮重要的作用。在KLF4啟動(dòng)子區(qū)含有3個(gè)SP1的結(jié)合位點(diǎn)，用一系列截短的KLF4啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)只有含有SP1結(jié)合位點(diǎn)的片段才可以被PDGF-BB活化〔28〕。另外，過表達(dá)SP1可以增加KLF4啟動(dòng)子的活性。而且用SP1特異性的小干擾RNA抑制內(nèi)源性SP1的表達(dá)后，明顯減弱PDGF-BB對(duì)KLF4表達(dá)的影響〔28〕。突變KLF4啟動(dòng)子上的3個(gè)SP1結(jié)合位點(diǎn)也可以明顯減弱PDGF-BB對(duì)KLF4表達(dá)的影響〔28〕。這些結(jié)果均表明，PDGF-BB體外刺激或者血管受到損傷時(shí)都可以增加SP1與KLF4啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。這些結(jié)果表明SP1能夠直接結(jié)合到KLF4啟動(dòng)子區(qū)調(diào)節(jié)KLF4基因的表達(dá)。因此，在血管損傷誘導(dǎo)SMC表型轉(zhuǎn)化過程中，至少部分是通過SP1上調(diào)KLF4的表達(dá)發(fā)生作用的〔28〕。

3.5 TGF-β1誘導(dǎo)KLF4表達(dá) 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(TGF-β1)是一類多肽類生長(zhǎng)因子，具有多種生物學(xué)功能，通過與受體TβRI(TGF-β type I receptor)或 TβRⅡ(TGF-β type Ⅱ receptor，TβRⅡ)相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡〔29〕。研究發(fā)現(xiàn)，在VSMC表型轉(zhuǎn)化過程中，TGF-β1能夠顯著誘導(dǎo) KLF4的表達(dá)〔30〕，TGF-β1也可以誘導(dǎo)VSMC標(biāo)志基因的表達(dá)。但是TGF-β1誘導(dǎo)KLF4表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。

3.6 Notch對(duì)KLF4啟動(dòng)子的活性的抑制 Notch通路在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮著重要的作用，在小鼠的胃腸道杯狀細(xì)胞分化過程中，通過抑制KLF4基因從而調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞分化〔31〕。但是Notch并不直接抑制KLF4的表達(dá)，可能是通過與ICN1(ICN1，a COOH-terminal region of human Notch1)效應(yīng)元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮間接作用。ICN1效應(yīng)元件在啟動(dòng)子上游151和122間的核苷酸，能與KLF4啟動(dòng)子上ICN1效應(yīng)元件相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子FoxD3可能介導(dǎo)Notch對(duì)KLF4的抑制。然而，Notch和FoxD3之間的關(guān)系仍然不清楚，Notch信號(hào)通路可能直接或間接地調(diào)節(jié)FoxD3。FoxD3與KLF4啟動(dòng)子上ICN1效應(yīng)元件的結(jié)合，F(xiàn)oxD3對(duì)KLF4的調(diào)節(jié)目前仍不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，在腸上皮細(xì)胞Notch信號(hào)抑制KLF4表達(dá)〔32〕。在腸腫瘤和結(jié)直腸癌細(xì)胞中Notch表達(dá)上調(diào)，抑制Notch能夠上調(diào)KLF4的表達(dá)，促進(jìn)杯狀細(xì)胞的分化，抑制增殖和腫瘤的形成。

3.7 在VSMC中維甲酸衍生物ATRA誘導(dǎo)KLF4表達(dá) 全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)通過與胞內(nèi)受體RAR/RXR作用在多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。ATRA能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的VSMC由去分化型向分化型轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)，ATRA呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性誘導(dǎo)KLF4的表達(dá)〔33〕。但是對(duì)ATRA調(diào)控KLF4基因表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。

3.8 炎癥因子誘導(dǎo)KLF4表達(dá)，抗炎因子抑制KLF4表達(dá) 在巨噬細(xì)胞中，干擾素-γ(IFN-γ)，脂多糖(LPS)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性細(xì)胞因子可以顯著誘導(dǎo) KLF4表達(dá)〔34〕，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的激活，一些抗炎因子如TGF-β1能減輕炎癥反應(yīng)，抑制KLF4的表達(dá)。Chen等發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，IFN-γ能夠上調(diào)KLF4的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡〔35〕。

3.9 某些化學(xué)物質(zhì)上調(diào)KLF4的表達(dá)

3.9.1 在結(jié)腸癌細(xì)胞中，丁酸鹽反式激活KLF4 KLF4在結(jié)腸癌中表現(xiàn)的一些生理學(xué)性質(zhì)與短鏈脂肪酸相似，在HT-29細(xì)胞中，丁酸鹽能夠誘導(dǎo)KLF4 mRNA的表達(dá)，反式激活KLF4啟動(dòng)子活性〔36〕。丁酸鹽對(duì)KLF4的反式激活可能是通過與KLF4啟動(dòng)子上SP1結(jié)合區(qū)相互作用，也可能參與組蛋白的乙?；饔谩?6〕。在KLF4啟動(dòng)子上游109和91間共有序列SP1的結(jié)合區(qū)，含有丁酸鹽反應(yīng)元件。在結(jié)腸癌中，KLF4是丁酸鹽下游區(qū)的效應(yīng)器，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)〔36〕。

3.9.2 硒在生長(zhǎng)抑制中，KLF4是硒的一個(gè)新的介質(zhì) 給予硒可以有效降低前列腺癌的發(fā)生率，抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在前列腺癌細(xì)胞中，硒上調(diào)KLF4的表達(dá)，并且增加KLF4的DNA結(jié)合活性〔37〕。用小干擾RNA敲低KLF4表達(dá)明顯減弱硒在抑制DNA合成，誘導(dǎo)凋亡，以及上調(diào)3個(gè)KLF4靶基因cyclinD1，p21/WAF1和 p27/Kip1的表達(dá)方面的作用〔37〕。因此，KLF4在硒抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中起了關(guān)鍵作用，是硒的一個(gè)重要的靶點(diǎn)。

3.9.3 環(huán)孢素A(CSA)上調(diào)KLF4表達(dá) CSA免疫抑制與高風(fēng)險(xiǎn)的動(dòng)脈移植，冠脈疾病，高血壓，高血脂相關(guān)，CSA能夠抑制培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和體內(nèi)損傷后的血管新生內(nèi)膜形成。在VSMC中，CSA也下調(diào)VSMC的分化標(biāo)志基因，而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑-1A(CDKN1A)和基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP3)。CSA上調(diào)KLF4的表達(dá)，促進(jìn)VSMC的表型調(diào)節(jié)〔38〕。

綜上，KLF4的表達(dá)受多種因素的精密調(diào)控。盡管目前對(duì)KLF4基因表達(dá)調(diào)控的研究在逐漸增多，但對(duì)于KLF4調(diào)控的各種因素如何在體內(nèi)相互作用并共同調(diào)控KLF4基因的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。

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