幾種常見食用菌胞外酶活性測定方法的研究1）

呂春鶴，孫婷婷，張健，孟東陽，鄒莉

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

食用菌在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生胞外酶，食用菌胞外酶可以分解培養(yǎng)料使多糖、蛋白質(zhì)、核酸等天然高聚物裂解成食用菌菌絲和子實(shí)體便于吸收的小分子物質(zhì)，為食用菌菌絲生長、原基形成、子實(shí)體生長發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)［1］。因此，食用菌胞外酶在食用菌生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，其胞外酶的酶活力也就成為了重要的測定對象。通過對酶活的測定可以清晰地看出各種胞外酶對菌料的分解程度與分解效率，以便于使食用菌菌絲及子實(shí)體更好更快生長。并且就食用菌的生長發(fā)育過程來看，了解食用菌胞外酶活性的變化趨勢，可以進(jìn)一步探究食用菌的營養(yǎng)生理，提高栽培技術(shù)。在食用菌胞外酶中，羥甲基纖維素酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、多酚氧化酶、半纖維素酶等均對食用菌生長起著很大的作用［2－8］，但其中最為主要的酶有羥甲基纖維素酶、淀粉酶、漆酶。所以下面將會對這幾種酶的測定方法進(jìn)行主要分析。

1 漆酶

漆酶屬于多銅氧化酶家族中的一大類，利用分子氧通過自由基－催化反應(yīng)機(jī)制來氧化各種芳香族和非芳香族化合物［9］，是一種糖蛋白。是與木質(zhì)素等大分子物質(zhì)降解有關(guān)的酚氧化酶，它能加速木質(zhì)素芳香族化合物的分解，為菌絲提供營養(yǎng)。胞外漆酶活性越高菌株分解木質(zhì)素能力就越強(qiáng)。目前測定漆酶酶活的方法有分光光度法、測O2法、高效液相色譜法、極譜法、脈沖激光光聲分析法、微量熱法等。其中最常用的方法為分光光度法，而在分光光度法中比較常用的有鄰聯(lián)甲苯胺法，ABTS法，愈創(chuàng)木酚法等。因?yàn)椴煌瑏碓吹钠崦概c底物反應(yīng)的親和力不同，即使同一來源的漆酶，底物不同，反應(yīng)的親和力也不同，測得的酶活數(shù)值就不同。因而，目前也沒有統(tǒng)一的方法來測定漆酶酶活。以下總結(jié)了最常用的分光光度法中的幾種常見方法并進(jìn)行了比較分析。

1.1 鄰聯(lián)甲苯胺法

鄰聯(lián)甲苯胺法測定漆酶酶活是以鄰聯(lián)甲苯胺為底物，以醋酸溶液反應(yīng)體系為緩沖溶液，pH值為4.0或4.6，緩沖溶液的濃度有0.039、0.077、0.085 mol／L 3種。反應(yīng)溫度可選擇在25、28、30、40℃，反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度有關(guān)，30℃和40℃一般反應(yīng)5min，25℃和28℃一般反應(yīng)30min，分光光度計(jì)波長一般在600nm。鄰聯(lián)甲苯胺容易購買且價格相對ABTS便宜，可選擇的反應(yīng)溫度多，在30和40℃時反應(yīng)時間短，但鄰聯(lián)甲苯胺毒性較強(qiáng)，且該底物水溶性差，所以測定的酶活力低。

1.2 ABTS法

ABTS法是最常用和使用最廣泛的漆酶酶活測定方法。其酶活反應(yīng)的底物為ABTS（3－乙基苯并噻唑－6－磺酸），ABTS經(jīng)漆酶作用后形成ABTS自由基，ABTS的濃度在0.1～5mmol／L，常用0.5mmol／L反應(yīng)的緩沖體系為醋酸溶液反應(yīng)體系，pH值一般在4.0～5.0，常用pH值為5.0，反應(yīng)一般在室溫下（25℃）進(jìn)行，但有時為了防止過氧化氫［10］的影響也會選擇在較高溫度下反應(yīng)。分光光度計(jì)的波長一般為420nm［11－12］，也有報(bào)導(dǎo)用波長為436nm［13］測吸光度。

雖然ABTS市場價格較高，但漆酶對ABTS的親和力強(qiáng)，反應(yīng)催化能力高，ABTS為底物測漆酶活性反應(yīng)靈敏度高，因?yàn)锳BTS是直接測定產(chǎn)生的ABTS陽離子自由基，ABTS離子自由基在水溶液中比較穩(wěn)定所以測出的OD值也精確，因此該方法為測定漆酶酶活較實(shí)用、較精確的方法。

1.3 愈創(chuàng)木酚法

反應(yīng)底物為愈創(chuàng)木酚，底物的3種常用終濃度為0.4、0.8、1.0mmol／L。緩沖溶液常用琥珀酸鈉溶液，pH 值一般為4.5，濃度為0.05mol／L，也有用磷酸鈉緩沖溶液的。反應(yīng)一般在30℃下反應(yīng)30min，分光光度計(jì)波長為465nm［17］。

漆酶在作用于愈創(chuàng)木酚時產(chǎn)生的物質(zhì)由于不穩(wěn)定可轉(zhuǎn)化為多種形式，有醌類物質(zhì)、聚合物和C－O，C－C偶聯(lián)產(chǎn)物［14－16］，由于只是在某波長下測定產(chǎn)物醌類物質(zhì)的數(shù)量來計(jì)算酶活，所以最后測定的酶活不準(zhǔn)確（偏低）。醌類物質(zhì)的量不確定，酶活測定也存在不穩(wěn)定性，且此種方法反應(yīng)時間過長。

根據(jù)國外的文獻(xiàn)報(bào)道，常用ABTS法或丁香醛連氮法測定漆酶酶活，國內(nèi)常用ABTS法、愈創(chuàng)木酚法和鄰聯(lián)甲苯胺法測定漆酶。

2 羥甲基纖維素酶

纖維素酶是一種復(fù)合酶，由內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶構(gòu)成［18］。因此測定纖維素酶活的方法可分為纖維素酶總酶活力測定與單一纖維素酶組分的測定。對于單一纖維素酶組分的測定方法，其中以羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測定方法最為常見［19］。

在測定纖維素酶總酶活力時，可選擇的底物是多種多樣的，有熒光定糖法、濾紙酶活（FPA）測定法等多種方法。即使這樣，現(xiàn)代測定纖維素的方法已基本明確。下面將會介紹幾種常用的測定纖維素酶酶活的方法。

2.1 濾紙酶活（FPA）測定法［20］

此方法以纖維素酶作用于濾紙后生成的還原糖量來表征纖維素酶的糖化能力。很多文獻(xiàn)報(bào)道該方法在pH值為4.6的醋酸緩沖溶液中，與1條lcm×6cm新華濾紙（50±1 mg）在50℃下反應(yīng)60min，DNS顯色5min，于520nm處測定OD值，也有報(bào)道稱是在530nm處測定OD值［21］。此方法較為穩(wěn)定，是一種公認(rèn)的、經(jīng)典的方法。但此種方法由于其底物濾紙是不溶性的，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且影響因素較多，耗時較長［22］，所以大部分實(shí)驗(yàn)室對其進(jìn)行了改良。此方法更適于高酶活的樣品。

2.2 羧甲基纖維素鈉鹽酶活性測定方法［20］

纖維素酶作用于CMC－Na，使其降解，生成纖維二糖、葡萄糖等還原糖，在堿性條件下能將3，5－二硝基水楊酸（DNS）還原，生成棕紅色的氨基化合物，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)液，22PC分光光度計(jì)在520nm處測其吸光度，以每分鐘生成相當(dāng)于1μmol的葡萄糖為一個酶活性單位［23］，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度呈比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖維素酶的活力。反應(yīng)應(yīng)在pH值為4.6的醋酸－醋酸鈉緩沖液中進(jìn)行，于50℃水浴鍋中反應(yīng)5min，加入DNS沸水浴反應(yīng)5min后測定OD值。生成棕紅色的氨基化合物。以羧甲基纖維素為底物測得的酶活值比以濾紙為底物測得的酶活值高，這說明酶對水溶性底物有較高的活力，同時也表明，吸附對酶的活性部位與纖維素分子鏈段的結(jié)合及催化均有很大影響［21］。于是，干寧、徐偉民等提出了用SiO2凝膠包埋葡萄糖氧化酶（GOD）電化學(xué)傳感器（GOD／SiO2）測定羥甲基纖維素酶活性的方法，此方法用SiO2包埋葡萄糖氧化酶，使其生物活性不被破壞且分布均勻。此種方法操作簡單、靈敏度高［19］。

2.3 熒光定糖法［24］

熒光定糖法是通過測定生成的還原糖與反應(yīng)液生成熒光物的熒光強(qiáng)度來表征纖維素酶的酶活力。據(jù)報(bào)道稱熒光定糖法測定纖維素酶活力的最佳背景體系 為 46.7mg／g 乙醇胺 ＋46.7mg／g 硼酸 ＋50mmol／L檸檬酸，反應(yīng)體系為以46.7mg／g乙醇胺＋46.7mg／g硼酸＋50mmol／L檸檬酸＋20μg葡萄糖，反應(yīng)時間為10min，反應(yīng)溫度為150℃。此種方法簡單快速，專一性強(qiáng)，具有較高靈敏度，適于纖維素酶活力的大量樣品的測定，但此方法更適于低濃度纖維素酶活力的測定。

3 淀粉酶

淀粉酶是α－淀粉酶、β－淀粉酶及葡糖淀粉酶的總稱，一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等α－1，4－葡聚糖，水解α－1，4－糖苷鍵的酶。根據(jù)酶水解產(chǎn)物異構(gòu)類型的不同可分為α－淀粉酶與β－淀粉酶。微生物中主要的兩種淀粉酶為α－淀粉酶及葡糖淀粉酶。測定淀粉酶的方法有很多種，如碘－淀粉比色法、3，5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）等。

3.1 碘－淀粉比色法

淀粉經(jīng)α－淀粉酶催化水解，生成產(chǎn)物為葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物淀粉濃度已知且過量的條件下，反應(yīng)后加入碘液與末被催化水解的淀粉結(jié)合成藍(lán)色復(fù)合物。將其藍(lán)色的深淺與未經(jīng)酶促反應(yīng)的空白管比較，從而計(jì)算出淀粉的量，推算出淀粉酶的酶活力。此反應(yīng)應(yīng)在pH值為7.0、酶底物淀粉濃度為0.4g／L的緩沖液的體系中進(jìn)行，在40℃下和底物淀粉作用30min，于660nm波長處測定吸光度值［25］。碘－淀粉比色法測淀粉酶活力具有操作簡便迅速、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，但此方法也有重復(fù)性差，準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)［26］。

3.2 3，5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）［27］

此法是用比色法測定淀粉酶作用于淀粉后生成的還原糖的量來表征淀粉酶的酶活力。反應(yīng)是在pH值為5.6的檸檬酸緩沖液中進(jìn)行，取檸檬酸淀粉緩沖液與淀粉酶混勻，于60℃水浴中保溫30min，將酶液與顯色劑DNS于40℃水浴中5min，于520 nm波長下測吸光度值，然后計(jì)算酶活力。在DNS比色法中，所用試劑易得，溶液有效期長，精確度高，結(jié)果較為穩(wěn)定可靠都是此方法的優(yōu)點(diǎn)，但相對于碘－淀粉比色法它的操作則較為復(fù)雜。

4 小結(jié)與展望

隨著人們對食用菌胞外酶研究的不斷深入，測定酶活的方法也越來越多。但因各種測定方法均各有利弊，所以我們需要根據(jù)不同的情況，來具體討論采用何種方法測定酶活。不同的酶活力測定方法，因反應(yīng)機(jī)制不同，反應(yīng)時間不同，同種酶活性不同，導(dǎo)致不同研究者和不同文獻(xiàn)中對同一種酶的酶活測定也無法進(jìn)行分析比較。因此，將各種酶活力測定方法進(jìn)行歸納整理很有必要，可以讓研究者有一個更有價值和科學(xué)的方法來分析比較。但無論方法怎樣多變，各種酶活的測定方法都將會朝著操作簡便、快捷、高靈敏度方向發(fā)展。

綜上所述，自胞外酶被人們研究利用以來，其各種酶的酶活測定方法就不斷涌出，但自動化測定酶活的方法還是占據(jù)了小部分，隨著科技的進(jìn)步，復(fù)雜繁瑣的人工測定酶活的方法終將會被簡便的自動化方法所取代。精密儀器的使用也會越來越普遍。更好的測定方法會使得測定出的數(shù)據(jù)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，使得科學(xué)研究、應(yīng)用生產(chǎn)等工作更加順利的進(jìn)行。

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