戶太8號葡萄組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

張繼東

（甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水741020）

戶太8號葡萄是陜西省戶縣葡萄研究所歷時(shí)8年，以當(dāng)?shù)仄贩N為砧木，以巨峰的奧林匹亞芽變?yōu)榻铀?，?jīng)系統(tǒng)選育而成的葡萄新品種。其主要特點(diǎn)是：極早熟，豐產(chǎn)，粒大，色艷，味佳，有香氣，樹勢強(qiáng)旺，抗寒、抗旱、抗病蟲害能力強(qiáng)，可二次結(jié)果，耐貯運(yùn)。該品種自發(fā)芽到漿果完熟僅需95～105d，定植后2～3年，產(chǎn)量可達(dá)1.5萬～3萬kg／hm2，5年后產(chǎn)量可達(dá)4.5萬kg／hm2以上。果穗平均重600～800g，果粒著生緊湊，果粒前半端為紫黑色，后半端到尾柄為紫紅色。果粒大，平均重15g，最小12g，最大達(dá)18g。果肉致密，肉質(zhì)脆，果肉與果皮、種子易分離，味酸甜適口，含糖量17.3%，含酸量0.5%。在－13℃條件下，無需任何防寒措施即可安全越冬，在最低氣溫達(dá)－17℃時(shí)，仍然豐產(chǎn)。對葡萄常見病害霜霉病、白腐病、黑痘病、灰霉病等抗性均強(qiáng)，不怕日灼，易管理［1］。

近幾十年來，隨著生物工程技術(shù)的不斷進(jìn)步和完善，在園藝產(chǎn)業(yè)方面的應(yīng)用也越來越廣泛，這不僅極大地促進(jìn)了園藝產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，也給相關(guān)產(chǎn)業(yè)注入了生機(jī)和活力。特別是利用生物工程技術(shù)方法之一的植物組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)，進(jìn)行苗木繁殖，更是對常規(guī)繁殖技術(shù)的一次重大革命，顯示了強(qiáng)大的生命力和廣闊的發(fā)展前景。許多植物品種，常常因常規(guī)繁殖方法和種源材料的限制，難以迅速大量繁殖，或者繁殖系數(shù)極低，不能及時(shí)滿足生產(chǎn)和市場需求，在一定程度上制約了產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展和產(chǎn)業(yè)水平的提升。

戶太8號葡萄一般采用扦插繁殖或嫁接繁殖，扦插和嫁接繁殖受種源材料限制及繁殖系數(shù)低等因素的影響，均不能取得預(yù)期效果。采用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)繁殖既可以得到整齊一致的無性系材料，又能提高繁殖系數(shù)，在短期內(nèi)獲得大量苗木。能克服常規(guī)繁殖的弊端，為戶太8號葡萄的推廣和產(chǎn)業(yè)化提供保障，具有較為廣泛的社會效益、生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

戶太8號外植體材料采自甘肅省天水市麥積區(qū)中山流域葡萄園6年生葡萄園。培養(yǎng)基中添加的化學(xué)試劑產(chǎn)自天津化工試劑廠和西隴化工試劑廠，無機(jī)試劑均為分析純，有機(jī)試劑和激素為化學(xué)純和生物純，母液配制和培養(yǎng)基用水均為蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 器皿洗滌。試驗(yàn)在甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，于2011年4月開始試驗(yàn)。培養(yǎng)瓶去除內(nèi)外壁殘?jiān)?，用清水沖去殘?jiān)?，沖凈后將培養(yǎng)瓶浸泡在溫水中，經(jīng)一段時(shí)間后加入洗滌劑，用毛刷刷洗內(nèi)壁，用洗潔球擦洗外壁，直到培養(yǎng)瓶內(nèi)外壁達(dá)到“不掛水珠，水膜均勻，透明锃亮”的標(biāo)準(zhǔn)為止，然后用蒸餾水涮洗1次，自然晾干備用。容量瓶、移液管、量筒和貯液瓶等器皿可先用濃鉻酸洗液洗滌，再用清洗培養(yǎng)瓶的方法洗滌。

1.2.2 配方選擇。通過查閱資料和咨詢相關(guān)研究院所，選取B5為基本培養(yǎng)基，添加的激素有6－BA和IAA兩種，附加有蔗糖、活性炭和瓊脂［2］。

1.2.3 母液及激素配制。為了減少工作量和減少誤差，可以將工作液配成高濃度的母液。由于母液濃度高，培養(yǎng)基成分中的一些陰陽離子會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成養(yǎng)分損失，根據(jù)化學(xué)試劑的性質(zhì)，將基本培養(yǎng)基中成分分成6組，配成6液式，可以防止養(yǎng)分損失。激素也可以配制成高濃度溶液，便于制作培養(yǎng)基時(shí)添加。在配制之前，根據(jù)所需培養(yǎng)瓶苗的數(shù)量確定母液的擴(kuò)大倍數(shù)，制訂母液和激素配制表，配制時(shí)根據(jù)母液和激素配制表進(jìn)行配制。配好定容后轉(zhuǎn)液到貯液瓶中，貼上標(biāo)簽，標(biāo)明名稱，擴(kuò)大倍數(shù)，定容體積，制作人和時(shí)間等，存放到2～4℃冰箱中即可，有效期180d。

1.2.4 培養(yǎng)基制備及滅菌。根據(jù)配方、母液、激素配制表和需要制作的培養(yǎng)基的升數(shù)，計(jì)算抽取所需母液和激素的體積數(shù)，蔗糖、活性炭和瓊脂用量。以制作2L培養(yǎng)基為例，先在鍋內(nèi)加入1.5L蒸餾水，量取母液和激素，并加入鍋內(nèi)，補(bǔ)充水量到2L，再分別加入蔗糖和瓊脂，稱鍋和液體的重量，然后煮制，燒開后，調(diào)整pH值到6.0（經(jīng)高壓滅菌后，pH值會下降0.2個(gè)單位），再稱重并補(bǔ)充散失的水分。分裝在培養(yǎng)瓶中，初代培養(yǎng)按25瓶／L分裝，繼代培養(yǎng)按20瓶／L分裝，先將活性炭用小勺裝入培養(yǎng)瓶中，再將培養(yǎng)基灌入培養(yǎng)瓶，用封口膜封口。置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌處理，完全排盡空氣后，在103.4kPa（1.05kg／cm2）蒸汽壓下，溫度達(dá)到121℃，維持20min，鍋體溫度降為100℃時(shí)，先打開排氣閥，再揭開鍋蓋取出培養(yǎng)基，置于擱架上至完全冷卻，冷卻期間不能晃動(dòng)，以免影響瓊脂的凝固能力。在室溫下預(yù)培養(yǎng)一周后，檢查沒有污染就可以進(jìn)行接種。

1.2.5 母株選擇及預(yù)處理。選擇田間生長健壯，無病蟲害，豐產(chǎn)性好，綜合品質(zhì)優(yōu)良的植株，作生物學(xué)調(diào)查后，標(biāo)記作為外植體采集母株。在采集外植體之前，可先對母株進(jìn)行施肥、澆水、病蟲害防治和遮蔭等措施，提高初代培養(yǎng)成功率。

1.2.6 外植體的采集及處理。春季戶太8號葡萄當(dāng)年生嫩枝長到10～15cm左右時(shí)，在連續(xù)2～3個(gè)晴天后的上午10時(shí)左右，選取生長健壯，無病蟲害的枝條進(jìn)行采集，采集后及時(shí)剪掉葉片，要留有葉柄，并保濕，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室用軟毛刷或毛筆沾上洗衣粉或洗潔精對外植體表面進(jìn)行刷洗，清洗掉大的污物，將洗滌劑沖洗干凈后，再用鋒利刀片把嫩枝切成單芽莖段，因?yàn)轫斞刻?，表面滅菌時(shí)效果差，分切時(shí)全都拋棄處理。葉柄以上長0.3～0.5cm左右，葉柄以下長0.5～0.8cm左右，葉柄長0.5cm左右。切好的單芽莖段，放入250mL三角瓶中，每瓶45個(gè)，加入1000倍液的吐溫－80溶液200mL，并劇烈搖動(dòng)振蕩10～15min，讓外植體材料表面充分接觸溶液；處理后再用流水沖洗2～3h，以軟化“鈣斑”。

1.2.7 外植體表面滅菌。將流水中沖洗的單芽莖段瀝干后，置于提前30min運(yùn)行的超凈工作臺上，用不同濃度和不同處理時(shí)間的氯化汞溶液（新配）進(jìn)行表面滅菌處理；滅菌劑處理后，再用無菌水最少涮洗4次以上，每次不少于5min；并把莖段原來的切口用無菌刀片切掉，以免HgCl2溶液殘留切口影響成活［3］。然后在無菌條件下接種于B5基本培養(yǎng)基上，每瓶接種1個(gè)外植體（初代培養(yǎng)成功率最高），根據(jù)培養(yǎng)14d以后的生長情況確定最佳的氯化汞濃度、處理時(shí)間，見表1。

表1 氯化汞溶液不同處理濃度和不同處理時(shí)間對外植體成活率的影響

2 初代培養(yǎng)

2.1 配方篩選

初代培養(yǎng)配方進(jìn)行單因子試驗(yàn)篩選，選出最佳的初代培養(yǎng)基配方。基本培養(yǎng)基為B5＋蔗糖20g／L＋瓊脂5g／L＋活性炭，pH＝5.8，激素為6－BA和IAA。在接種室中，把處理好的單芽莖段在無菌條件下接種在培養(yǎng)瓶中，每瓶接種1個(gè)芽體。接種后28d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表2。

表2 戶太8號葡萄初代培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

2.2 培養(yǎng)環(huán)境管理

2.2.1 光質(zhì)。用日光燈提供光源，日光燈光質(zhì)可以滿足培養(yǎng)苗的生長需求。

2.2.2 光照強(qiáng)度。培養(yǎng)架層間距25～30cm，每層安裝3支日光燈管，全開時(shí)培養(yǎng)物附近的光強(qiáng)為2500～3000lx，初代培養(yǎng)前期光照不宜太強(qiáng)，可以用減少開關(guān)日光燈數(shù)量的方法控制光照強(qiáng)度，通常采用關(guān)閉中間日光燈的方法。

2.2.3 光周期。初代培養(yǎng)第1周，光周期為8h照光，16h黑暗；第2周光周期為12h照光，12h黑暗；第3周光周期為16h照光，8h黑暗；第4周與第3周光周期相同。

2.2.4 溫度管理。戶太8號葡萄初代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)室環(huán)境溫度維持在23～25℃范圍之內(nèi)，都適宜于培養(yǎng)苗的生長。

2.2.5 濕度管理。適宜的培養(yǎng)室空氣相對濕度范圍為60%～80%，空氣相對濕度小于60%，培養(yǎng)基易失水濃縮，影響培養(yǎng)物的生長，用加濕器或地面灑水的方法來增濕；空氣相對濕度大于80%，培養(yǎng)基極易受菌類污染，使污染率急劇增加，并且造成的污染將無法控制，使培養(yǎng)物受污染死亡，導(dǎo)致培養(yǎng)徹底失敗，用抽濕機(jī)可以有效降低培養(yǎng)室的空氣相對濕度。進(jìn)過30d左右的培養(yǎng)，就可以完成初代培養(yǎng)過程。

3 繼代培養(yǎng)

3.1 配方篩選

繼代培養(yǎng)配方進(jìn)行單因子試驗(yàn)篩選，選出最佳的繼代培養(yǎng)基配方?；九囵B(yǎng)基為B5＋蔗糖20g／L＋瓊脂5g／L＋活性炭，pH＝5.8，激素為IAA。在無菌條件下，將初代培養(yǎng)的芽體用無菌的彎頭剪刀在培養(yǎng)瓶內(nèi)分切成長1cm左右的莖段，再用無菌的槍狀鑷子轉(zhuǎn)接在繼代培養(yǎng)基中，每瓶3個(gè)莖段［3］。接種后28d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，見表3。

表3 戶太8號葡萄繼代培養(yǎng)基配方篩選試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)

戶太8號葡萄組織培養(yǎng)時(shí)的增殖方式是無菌短枝型（又稱微型扦插法），在增殖時(shí)，根系同時(shí)長出，一次成苗，根系發(fā)達(dá)［2］。平均每株在一個(gè)培養(yǎng)周期（28d左右）生根3～4條，根長均在5cm以上，在莖生長的同時(shí)，根系從莖段基部剪口處形成的愈傷組織上長出，因此不需要生根培養(yǎng)過程。

3.2 培養(yǎng)環(huán)境管理

3.2.1 光質(zhì)。同初代培養(yǎng)。

3.2.2 光照強(qiáng)度。培養(yǎng)架層間距25～30cm，每層安裝3支日光燈管，繼代培養(yǎng)光照要維持在3000lx左右，如有壞了的燈管，要及時(shí)進(jìn)行更換，否則會影響組培苗的正常生長。

3.2.3 光周期。繼代培養(yǎng)光周期為24h全關(guān)照，也可以16h照光，8h黑暗處理，兩種光周期效果對組培苗生長影響差異不明顯，但24h照光可以延長燈管使用壽命，比16h照光更節(jié)省成本。

3.2.4 溫度管理。戶太8號葡萄繼代培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)室環(huán)境溫度要維持在25～27℃范圍之內(nèi)，均是組培苗生長適宜的溫度范圍。

3.2.5 濕度管理。同初代培養(yǎng)管理，進(jìn)過28d左右的培養(yǎng)，就可以完成一次繼代培養(yǎng)過程。

4 煉苗移栽

4.1 煉苗

4月初，將完成一個(gè)培養(yǎng)周期的瓶苗轉(zhuǎn)入日光溫室內(nèi)，先不打開瓶塞，溫度控制在15～25℃，用逐漸減少遮陰的方法，7d之內(nèi)把光強(qiáng)逐漸升高20000 lx左右。在相對濕度不低于70%的條件下，打開瓶塞，繼續(xù)鍛煉3～5d，使瓶苗適應(yīng)溫室環(huán)境。

4.2 移栽

從瓶內(nèi)用鑷子夾取出試管苗，沖洗干凈根系的培養(yǎng)基，用1000倍液的多菌靈溶液浸泡5min，然后栽植到營養(yǎng)缽中（基質(zhì)采用蛭石或珍珠巖），用滲透的方法澆上水，放入日光溫室內(nèi)的小拱棚中。濕度保持在近飽和狀態(tài)，溫度控制在20～25℃，光強(qiáng)15000～20000lx。3d后濕度降到85%，光強(qiáng)逐漸增大到40000lx，當(dāng)有明顯生長時(shí)，將苗子移入基質(zhì)為土∶沙∶腐熟有機(jī)肥（1∶1∶0.5）的營養(yǎng)缽中，逐漸改變小拱棚環(huán)境，使其與溫室環(huán)境相同，最后揭掉棚膜，使苗木適應(yīng)露地生長環(huán)境，當(dāng)組培苗在營養(yǎng)缽中新長出的枝條長5cm左右時(shí)，便可移入大田，栽培管理措施與常規(guī)大田育苗相同［4］。

采用分步煉苗和移栽，雖然工序多，但整個(gè)過程中組培苗無停長，成活率可達(dá)80%以上，培育到秋季，苗木可達(dá)到出圃要求。

5 結(jié)論

以戶太8號葡萄春季萌發(fā)的半木質(zhì)化嫩枝作為外植體，從試驗(yàn)材料與方法、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、煉苗移栽等四方面，進(jìn)行了兩年的試驗(yàn)，成功獲得了初代培養(yǎng)配方B5＋6－BA3mg／L＋I(xiàn)AA 1mg／L＋蔗糖20g／L＋瓊脂5g／L＋活性炭，pH＝5.8；繼代培養(yǎng)配方B5＋I(xiàn)AA 1mg／L＋蔗糖20g／L＋瓊脂5g／L＋活性炭，pH＝5.8；以及煉苗移栽技術(shù)，掌握了初代和繼代培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)環(huán)境，初代培養(yǎng)成功率最高達(dá)到36%，繼代培養(yǎng)周期25～28d，繁殖系數(shù)6.2，移栽成活率90%以上。試驗(yàn)從生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，通過精心細(xì)致研究，繼代擴(kuò)繁優(yōu)質(zhì)戶太8號瓶苗5.6×103余瓶，煉苗移栽可生產(chǎn)組培苗1.2×104萬余株?？偨Y(jié)出了戶太8號葡萄組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，為戶太8號葡萄的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了技術(shù)支撐。

［1］ 紀(jì)檢.葡萄新品種——戶太8號［J］.陜西林業(yè)科技，1996（2）：73.

［2］ 曹孜義，劉國民.實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程［M］.蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1996：121－124.

［3］ 張繼東，常德昌.萊陽矮櫻桃組織培養(yǎng)及快繁研究［J］.河西學(xué)院學(xué)報(bào)，2003（2）：97－98.

［4］ 張繼東.棣棠組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)［J］.中國林副特產(chǎn)，2009（6）：54－55.