miRNA與神經(jīng)退行性疾病研究進展

周風(fēng)華 管英俊 張彩霞 陳燕春 (濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

小分子RNA(miRNAs)是一種約21～25個核苷酸、進化保守內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，由基因組轉(zhuǎn)錄生成。通過與靶基因的互補配對裂解靶mRNA或抑制翻譯，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)合成缺失或減少，從而發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的功能〔1，2〕。miRNAs調(diào)控機體約90%以上的基因表達(dá)，據(jù)推測，人體組織細(xì)胞內(nèi)的每一個生理過程幾乎均受miRNA的調(diào)控〔3〕。生物信息學(xué)預(yù)測，人類30%編碼蛋白基因由miRNA調(diào)控〔4〕。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常表達(dá)廣泛參與了人類心血管疾病、惡性腫瘤和腦血管疾病等重大疾病的發(fā)生及發(fā)展。同時研究也發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程及多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生。本文從miRNA的生物合成及作用機制、miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系以及miRNA在重要的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中的作用進行綜述。

1 miRNA的生物合成及作用機制

大多數(shù)miRNA被特定的轉(zhuǎn)錄子表達(dá)，往往首先被轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，然后再進行加工形成成熟的miRNA。在細(xì)胞核內(nèi)，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下，轉(zhuǎn)錄合成原始miRNA(primiRNA)，pri-miRNA經(jīng)Dorsha酶切產(chǎn)生約70個核苷酸并形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA(pre-miRNA);pre-miRNA通過Ran-GTP依賴性核漿轉(zhuǎn)運子Exportin-5從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA將被Dicer加工處理，Dicer是miRNA合成過程中一種重要的RNA核酸酶，具有裂解雙鏈RNA的作用。Dicer酶識別pre-miRNA，從發(fā)夾結(jié)構(gòu)的一段將環(huán)打開，釋放一個包含成熟miRNA的雙鏈RNA，這種雙鏈被引導(dǎo)進入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)中，成熟的單鏈miRNA分子整合入RISC后形成miRNA復(fù)合物(miRISC)，另一條則可能迅速降解。miRNA對靶基因的識別通過一段不完全匹配的序列來介導(dǎo)，而其他核苷酸則根據(jù)不同的特點來調(diào)節(jié)miRNA與靶基因的結(jié)合力〔5〕。這種復(fù)雜的作用機制表明單個miRNA可以調(diào)節(jié)多個靶基因，而一個靶基因也可以被多個miRNA所調(diào)節(jié)。被miRNA識別的區(qū)域被稱為miRNA反應(yīng)元件(miRNA reaction element，MRE)，最初被認(rèn)為是 mRNA的3'UTR(Untranslated regions，UTR)區(qū)〔6〕，最近更多的研究證實，MRE 也可能位于 mRNA的 ORF(Open reading frame，ORF)和 5'UTR 區(qū)〔7〕。miRNA 與靶基因結(jié)合后可以抑制蛋白質(zhì)的翻譯或直接降解mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進行負(fù)調(diào)控。

2 miRNA與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育

miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性，存在于哺乳動物的各種組織中，具有復(fù)雜的功能。miRNA對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育及正常功能的維持均具有重要作用。

2.1 miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育過程中的作用 Dicer是miRNA生物合成過程中重要的RNA酶，Dicer酶的破壞能導(dǎo)致成熟miRNA的缺乏。Giraldez等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，Dicer的完全缺乏可以導(dǎo)致斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)的嚴(yán)重缺陷及神經(jīng)元分化障礙。De Pietri Tonelli等〔9〕在小鼠胚胎期9.5 d(尚未出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生)，選擇性敲除背側(cè)端腦神經(jīng)上皮的Dicer基因，通過對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，在胚胎期約12 d，神經(jīng)元凋亡增加，皮質(zhì)厚度明顯變薄;同時神經(jīng)元分化障礙，導(dǎo)致出生后皮層缺陷，皮質(zhì)體積明顯變小，斷奶后短時間內(nèi)會引起小鼠死亡。Huang等〔10〕發(fā)現(xiàn)通過Wnt1-Cre介導(dǎo)的Dicer基因敲除，除了引起一些特定細(xì)胞群比如多巴胺能神經(jīng)元分化障礙之外，還會引起中腦、小腦及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的畸形。Cuellar等〔11〕發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除多巴胺能神經(jīng)元的Dicer基因，導(dǎo)致了大腦萎縮和細(xì)胞體積減小，但是沒有出現(xiàn)神經(jīng)元的變性，并且發(fā)現(xiàn)相對于其他Dicer基因敲除的神經(jīng)元，如蒲肯野細(xì)胞〔12〕、皮質(zhì)和海馬〔13〕，可興奮神經(jīng)細(xì)胞，多巴胺能神經(jīng)元的壽命是延長的。Dicer基因的敲除除了影響神經(jīng)干細(xì)胞早期的分化之外，還會影響他們的生存〔14〕。

FMR1和FXR1這兩個基因可以與Dicer及RISC復(fù)合體中的成分相互作用。FMR1基因的突變能夠?qū)е律窠?jīng)發(fā)育遲緩。小鼠和黑腹果蠅這些基因的敲除能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)突觸形成的異常〔15〕。

Dgcr8是能與Drosha酶形成復(fù)合體的第3種蛋白，在primiRNA形成過程中 Dgcr8對于維持Drosha的活性是必須的〔16〕。Dgcr8基因的敲除會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形態(tài)異常和認(rèn)知障礙，如造成空間記憶依賴性的學(xué)習(xí)能力損傷。在細(xì)胞水平，由于最終缺乏復(fù)雜性的分支而造成樹突形成的改變。

Dicer、FMR1、FXR1及Dgcr8不僅參與了miRNA的生物合成，而且對于其他類型的小RNA比如siRNAs等的合成也具有重要作用，基因敲除不但會損傷miRNA的生物合成，也可能通過其他途徑影響神經(jīng)元的形成，因此，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的具體作用機制尚須進一步深入探討。

目前，有證據(jù)表明在多能干細(xì)胞向神經(jīng)元分化過程中，miRNA-124和miRNA-9發(fā)揮了重要作用，這也是研究最多的兩種miRNA。miRNA-124在分化中和成熟的神經(jīng)元中均表達(dá)，在小鼠腦組織中含量非常高，大約占腦組織總miRNA的25%～48%，人類、小鼠、大鼠的基因組中有3種同源的mir-124基因，包括 mir-124-1，mir-124-2，mir-124-3，mir-124-1 從果蠅到人類高度保守。HeLa細(xì)胞的基因芯片顯示，將miRNA-124注入HeLa細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)有100多種非神經(jīng)元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下調(diào)，同時誘導(dǎo)出現(xiàn)一些類似成熟神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)〔17〕。P19細(xì)胞miRNA-124的過表達(dá)可以誘導(dǎo)其向神經(jīng)元方向分化〔18〕，最近，miRNA-124在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生中的作用已經(jīng)在成年鼠體內(nèi)被證實，miRNA-124在室管膜下區(qū)的前體細(xì)胞表達(dá)，并且能夠影響前體細(xì)胞向特定神經(jīng)元表型的分化及成熟〔19〕。大腦皮質(zhì)發(fā)育過程中，miRNA-124的過表達(dá)能在活體內(nèi)誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生的增加〔20〕。另外一個在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的miRNA是miRNA-9，它高度保守，從果蠅到脊椎動物相似度高達(dá)100%。缺乏miRNA-9a的蒼蠅會導(dǎo)致感覺神經(jīng)元的位置異常及數(shù)量異常增加，表明miRNA-9a通過下調(diào)Sens基因表達(dá)來抑制神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化〔21〕。在小鼠大腦的發(fā)育過程中，miRNA-9的過表達(dá)能改變神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞的過早分化〔22〕。miRNA-9還參與脊髓運動神經(jīng)元亞型的分類〔23〕。mir-9在雞的脊髓瞬時表達(dá)，而且在外側(cè)運動神經(jīng)柱的運動神經(jīng)元表達(dá)。mir-9的過表達(dá)能夠使脊髓外側(cè)運動神經(jīng)柱的數(shù)量減少，也能改變軸突的突起，減少對翅肌的神經(jīng)支配。

2.2 MiRNAs與神經(jīng)元的形態(tài)和功能 miRNAs不僅參與神經(jīng)元的早期發(fā)育和分化，而且對于神經(jīng)元形態(tài)的維持及功能的發(fā)揮均具有重要作用。軸突和樹突對靶標(biāo)的正確延伸是神經(jīng)元發(fā)揮功能的前提。miRNAs豐度和對翻譯的調(diào)節(jié)對調(diào)控神經(jīng)突起的生成、生長和突觸形成是必需的。小RNA在神經(jīng)元胞體和樹突的差異表達(dá)譜表明，大部分miRNAs位于神經(jīng)元的樹突，而且在樹突和胞體呈梯度表達(dá)。在神經(jīng)元突起和突觸形成中研究較多的是mir-134和mir-132。mir-134是一種腦組織特異性miRNA，在樹突尤其是突觸中含量豐富。在海馬發(fā)育的過程中mir-134的表達(dá)水平增加，出生后13 d達(dá)到高峰〔24〕。肌源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和去極化刺激神經(jīng)元能誘導(dǎo)mir-379-410簇包括mir-134的表達(dá)〔25〕，這種誘導(dǎo)通過Mef2轉(zhuǎn)錄子介導(dǎo)，mir-134的目標(biāo)是Pumilio 2，它是一種RNA綁定蛋白，能夠抑制蛋白質(zhì)的翻譯與樹突的發(fā)生〔26〕。在樹突棘，Limk1的局部翻譯對于突觸棘的體積是很重要的，mir-134的靶轉(zhuǎn)錄子編碼Limk1，能夠抑制突觸棘的生長，神經(jīng)營養(yǎng)因子的刺激能夠抵抗mir-134對Limk1的抑制作用，恢復(fù)Limk1的局部翻譯〔24〕。在腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMPresponse element binding protein，CREB)的調(diào)控下，miRNA-132在培養(yǎng)的神經(jīng)元中表達(dá)。CREB是神經(jīng)元可塑性、成熟和形成過程中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，CREB的活化可以被神經(jīng)元電位相關(guān)的刺激因子快速誘導(dǎo)〔27〕，活化后的CREB誘導(dǎo)miRNA-132，通過活化GTP酶活化蛋白P250促進神經(jīng)突的生長〔28〕。

3 MiRNAs與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是由大腦和脊髓的神經(jīng)元退行性病變引起的一類疾病。主要包括阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)、帕金森病(PD)和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展。

3.1 MiRNAs與AD AD是以進行性癡呆為主要臨床表現(xiàn)的最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，其特征性病理變化是在腦組織中出現(xiàn)老年斑 (SP)和神經(jīng)纖維纏結(jié) (NFT)。老年斑主要由Aβ蛋白構(gòu)成，神經(jīng)元纖維纏結(jié)包括異常聚集和過度磷酸化的Tau蛋白。Aβ肽是有淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過β-分泌酶(BACE1依賴)和r-分泌酶(PSEN-早老素依賴)的順序裂解而產(chǎn)生。在APP和PSEN基因突變引起家族性AD的基礎(chǔ)上，Hardy等〔29，30〕提出了淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，表明 Aβ的過度產(chǎn)生單一的因素就可導(dǎo)致神經(jīng)纏結(jié)的形成及神經(jīng)元的死亡。最近，在人類臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，淀粉樣蛋白依賴的途徑不足以引起嚴(yán)重的神經(jīng)元退行性變及癡呆。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)生〔31～33〕與 miRNAs關(guān)系密切。

miRNAs與在AD領(lǐng)域的研究是Lukiw〔31〕通過對正常人及AD患者大腦中13種miRNA的觀察開始的。此后，研究者完成了總miRNA在AD大腦及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的分析〔34，35〕，鑒定了AD或神經(jīng)退行性疾病特異性miRNA，包括miR-29，miR-9，miR-15a，miR-181c，miR-101，miR-106b，miR-146a 和 miR-107。這些 miRNA中有一些能夠直接調(diào)節(jié) APP(miR-106，miR-101)〔33～36〕、BACE1(miR-29，miR-107)的產(chǎn)生〔31～33〕，引起淀粉樣蛋白的產(chǎn)生增加。

神經(jīng)元Dicer基因選擇性敲除的小鼠，不僅可以引起大腦體積縮小、腦室擴張、神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等〔13，14，37〕，同時還可導(dǎo)致AD樣的內(nèi)源性Tau蛋白的過度磷酸化〔13〕。Shin等〔38〕研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細(xì)胞中Dicer的丟失能引起神經(jīng)元軸突變性，同時伴有異常的軸突運輸及內(nèi)源性的APP的聚集。miRNA除了引起疾病相關(guān)基因如APP和BACE表達(dá)，可能通過更加精細(xì)的機制參與疾病的發(fā)生和發(fā)展。持續(xù)性miR-29缺乏不僅能導(dǎo)致BACE1和Aβ水平的升高，而且能夠影響神經(jīng)元的甲基化〔39，40〕。Wang 等〔41〕首 先 通 過 芯 片 技 術(shù) 檢 測 了 APPSwe-PS1M146L模型和AD小鼠全miRNA譜的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37 種不同表達(dá)的 miRNA 中，miR-20a、miR-29a、miR-125b、miR-128a和miR-106b的表達(dá)明顯下調(diào)，而miR-34a、let-7、miR-28和miR-98表達(dá)上調(diào)〔42，43〕。在突變的小鼠中 miR-34a的上調(diào)可以通過bcl-2調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔41〕。通過miRNA實時定量RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，miR-106b在AD小鼠3個月時上調(diào)，6個月時下調(diào)。

3.2 MiRNAs與ALS ALS是一種選擇性運動神經(jīng)元缺失的神經(jīng)退行性疾病，病變主要累及脊髓前角、腦干和額葉皮質(zhì)的運動神經(jīng)元。90% ～95%為散在性ALS(sporadic ALS，sALS)，病因不明，5% ～10%為家族性 ALS(familial ALS，fALS)，具有家族遺傳傾向，常表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，SOD1基因突變是fALS最常見的原因，約占 fALS的20%，TARDBP和 FUS/TLS基因突變約占fALS的10%，其他的一些基因，如ALS2、SETX、VAPB、ANG、FIG4、SPG11、DAO 和 OPTN 與一些罕見的或非典型的fALS有關(guān)。目前，關(guān)于ALS與miRNA的報道非常少見。

TDP-43(TAR DNA結(jié)合蛋白，TARDBP)是一種異質(zhì)性核糖核蛋白(hnRNPs)的同源異構(gòu)體，hnRNPs參與RNA的加工過程，TDP43是ALS和FTLD的一個關(guān)鍵因素。這種蛋白高度保守，廣泛表達(dá)，主要定位在細(xì)胞核，少量存在于細(xì)胞質(zhì)〔44〕，是神經(jīng)退行性疾病核內(nèi)包涵體的主要成份，它廣泛參與基因的轉(zhuǎn)錄、剪切、維持mRNA的穩(wěn)定性等過程。TARDBP基因的突變在3%～4%的fALS和約2%的sALS病人被發(fā)現(xiàn)。多數(shù)TARDBP基因突變是外顯子6的錯義突變，編碼甘氨酸豐富的C末端，允許結(jié)合單鏈DNA、RNA和蛋白質(zhì)。已有報道，TDP-43能夠與Drosha相互作用，從而參與pre-miRNAs的產(chǎn)生，促進miRNAs的合成。

miR-206是一種骨骼肌神經(jīng)肌肉特異性miRNA，是一種雙順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Williams等〔45〕發(fā)現(xiàn)，在G93A-SOD1轉(zhuǎn)基因鼠的下肢肌肉中檢測了320種miRNA，其中miR-206明顯上調(diào)，其上調(diào)與神經(jīng)癥狀的出現(xiàn)相伴隨。同時還發(fā)現(xiàn)，切斷坐骨神經(jīng)后，同樣也會引起miR-206明顯上調(diào)。引起miR-206上調(diào)的原因與骨骼肌蛋白和肌細(xì)胞生成素有關(guān)，這是兩種骨骼肌特異性的轉(zhuǎn)錄因子，通過與編碼miR-206的基因上游結(jié)合并且激活了miR-206的轉(zhuǎn)錄，使得miR-206的表達(dá)上調(diào)。為了明確miR-206在ALS中的作用，通過對miR-206-/-鼠發(fā)現(xiàn)，miR-206基因的丟失不會影響疾病的發(fā)作，但是可以加速疾病的進展，生存期縮短。通過對神經(jīng)肌肉連接處的研究進一步發(fā)現(xiàn)，miR-206能夠促進神經(jīng)肌肉突觸的代償性增生從而延緩ALS進展。

Haramati等〔46〕制備了運動神經(jīng)元(motor neuron，MN)Dicermut的小鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)，MNDicermut模型中miRNA活性喪失，功能學(xué)顯示去神經(jīng)性肌萎縮癥狀，表現(xiàn)為進行性運動功能障礙;形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腰段脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生;同時研究還發(fā)現(xiàn)脊髓運動神經(jīng)元軸突數(shù)量明顯減少，存活軸突雖然能夠到達(dá)運動終板，但是神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)處的結(jié)構(gòu)明顯異常，而脊髓背側(cè)的感覺神經(jīng)元軸突保持完整;進一步研究還發(fā)現(xiàn)MNDicermut小鼠不能正常協(xié)調(diào)神經(jīng)絲(NEF)亞單位，神經(jīng)絲重鏈(NEFH)表達(dá)明顯上調(diào)，miRNA-9明顯下調(diào)，而且進一步證實miRNA-9通過與NEFH mRNA的3'UTR的結(jié)合對NEFH的表達(dá)發(fā)揮了負(fù)調(diào)控作用。

De Felice等〔47〕通過對sALS病人的白細(xì)胞進行miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在人類911種miRNA中，hsa-miR-451，hsa-miR-1275，hsa-miR-328-5P，hsamiR-638，hsamiR-149 和 hsamiR-665表達(dá)明顯下調(diào)，miR-338-3p表達(dá)明顯下調(diào)，而這些差異表達(dá)的miRNA如何參與ALS的發(fā)生及發(fā)展仍需深入探討。

3.3 MiRNAs與其他神經(jīng)退行性疾病 PD是臨床常見的神經(jīng)退行性疾病之一，研究發(fā)現(xiàn)〔48〕miR-133b通過對Pitx3基因的調(diào)控參與了PD的發(fā)生。miR-433調(diào)控FGF20蛋白被翻譯，從而調(diào)節(jié)-synuclein的表達(dá)，參與了PD的發(fā)生〔49〕。HD是由于CAG三核苷酸重復(fù)序列過度擴展導(dǎo)致非正常亨廷頓蛋白產(chǎn)生的一種惡性常染色體顯性神經(jīng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA參與了HD的發(fā)生及發(fā)展，在HD小鼠中miR-124a〔50〕表達(dá)下調(diào)，在HD患者腦皮層中 miR-132、miR-9和miR-9〔51〕等表達(dá)下調(diào)，這些差異表達(dá)的miRNA通過對靶基因的調(diào)控廣泛參與了HD的發(fā)病。

總之，近幾年來，對miRNA的研究已成為生命信息領(lǐng)域中的一個重要方向。miRNA種類眾多，廣泛參與多種生物學(xué)過程，在體內(nèi)對靶基因發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。因此，研究miRNA的功能及調(diào)控機制對于揭示疾病的發(fā)生、發(fā)展、開發(fā)新的治療方案具有重要意義。

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