全麻機制研究——細胞內鈣離子信號通路研究進展

常 晶，陸 菡，于布為

(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院麻醉科，上海 200025)

隨著全身麻醉藥物的發(fā)展，全身麻醉由于其安全、舒適、無痛，已在臨床中得到廣泛應用。但是全身麻醉藥物作用機制的研究并沒有統(tǒng)一定論，對于其確切的分子和細胞作用機制仍存在爭議。目前普遍認為，全身麻醉藥物通過抑制興奮性神經元受體如AMPA受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate receptor，AMPAR)或易化抑制性神經元受體如GABAA受體(gamma-aminobutyric acid A receptor)來發(fā)揮作用，其中全身麻醉藥物對神經遞質釋放的影響長期受到廣泛關注。

細胞內游離鈣離子是細胞內重要的信使。鈣離子可以通過激活神經元促進神經遞質釋放，從而使得全身麻醉藥物調節(jié)細胞內鈣離子濃度成為潛在的全麻重要機制。在真核生物細胞，包括神經元細胞，主要通過跨膜通道使游離鈣離子進出細胞，并通過多種鈣離子轉運體系控制細胞內鈣離子濃度(［Ca2+］i)，而［Ca2+］i濃度升高即構成了細胞信號轉導的基礎［1］。本文將對調節(jié)細胞內鈣離子濃度的不同體系及全身麻醉藥物如何通過作用于這些體系來影響［Ca2+］i做一綜述。

1 鈣離子內流系統(tǒng)(Ca2+influx system)

細胞可以通過許多機制調節(jié)胞內游離鈣離子濃度，如電壓門控型鈣離子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)［2］，鈉-鈣 逆 向 轉 運 體 (sodium-calcium exchanger，NCE)［3］，允許鈣離子通過的AMPA型谷氨酸受體(calciumpermeable AMPARs)［4］，及存在于生殖系統(tǒng)介導鈣內流的CatSper通道［5］等。在這些機制中VGCC和NCE是已知的研究比較集中的兩種鈣離子內流體系。它們也被認為是全身麻醉藥物發(fā)揮突觸前效應的潛在作用位點。

1.1 電壓門控型鈣離子通道(voltage-gated calcium channels，VGCC)VGCC屬于大分子量超家族(200～500 ku)的成員，其上有許多糖基化位點，由5個亞基α1、α2、β、γ和δ構成［6］。脊椎動物體內包含多種鈣離子通道，可按照電生理特性、基因分類及結構特點的不同將其進行命名［7］。例如依據電生理特性，鈣離子通道可分為低電壓激活(low-voltage activated，LVA)快反應通道及高電壓激活(high-voltage activated，HVA)慢反應通道。而較常用的是按照抑制劑不同來分類［8］:可分為 N-型、T-型、L-型(3 者對二氫吡啶類敏感性不同，激活與滅活電位存在差異，并且N-型隨后被證明對多肽類毒素ω-conotoxin GVIA敏感);P-型(對ω-Aga-IVA抑制劑敏感);Q-型(存在于小腦神經元)［9］;R-型(對毒素 ω-Agatoxin-ⅢA敏感)。其中LVA通道或T-型鈣通道所呈現的電壓依賴性失活的快反應模式，被認為是中樞及外周神經元的膜電位波動的主要參與者。

關于全身麻醉藥物的突觸前效應存在許多不同觀點，而VGCC被認為是潛在位點之一。麻醉藥物可能通過抑制VGCC減少鈣內流，從而進一步干擾神經遞質的釋放:鈣離子通道開放誘發(fā)鈣離子流滲入通道，在局部小范圍內達到細胞內鈣閾值(～100 μmol·L-1)，隨之迅速引發(fā)對入胞的鈣離子敏感的突觸前結合蛋白產生胞吐作用，促使神經遞質釋放［10］，而麻醉藥物抑制了該通道的開放。因此VGCC作為快速突觸傳遞的結構基礎可以介導麻醉藥的突觸前效應。

1.2 鈉－鈣逆向轉運體(sodium-calcium exchanger，NCE)NCE是調節(jié)心肌細胞鈣離子動態(tài)平衡的重要膜蛋白，擔負著心肌正常收縮的重任。事實上心肌細胞的興奮-收縮偶聯(lián)很大程度上取決于鈣內流的變化，而電壓門控型鈣離子通道及鈉鈣交換體是唯一已知的兩種心肌細胞鈣內流機制［3］。

1.3 全身麻醉藥物對鈣內流的影響 2002年，Yamakage等［11］指出吸入性麻醉藥可以抑制VGCC的內流鈣離子流，從而抑制了突觸的信號轉運。Xie等［12］采用fura-2熒光標記法觀察牛嗜鉻細胞［Ca2+］i，發(fā)現異氟醚使細胞內鈣離子濃度增加，并進一步發(fā)現這種增加在很大程度上是由VGCC介導的。隨后Herring等［13］經過實驗證實了臨床濃度的異氟醚抑制神經遞質釋放的機制在于直接提高PC12細胞及海馬神經元細胞［Ca2+］i。事實上，全身麻醉藥對HVA鈣離子流的作用已經在許多細胞中得到證實，如神經元細胞、神經內分泌細胞、嗜鉻細胞、甲狀腺C細胞、心肌細胞及平滑肌細胞［14-16］。最新的研究表明［17］，異氟醚可以明顯抑制丘腦皮質神經元細胞膜T-型鈣通道的峰電流，并通過隨后的生物物理學研究指出這種抑制在細胞膜去極化時更易發(fā)生。

吸入性麻醉藥對心肌NCE有抑制效應。Seckin等［18］通過實驗證明，氟烷及較低濃度的七氟醚可以抑制NCE。同時指出吸入麻醉藥對心肌整體的抑制并不單純取決于NCE，而是通過抑制VGCC、NCE及肌漿網鈣離子釋放而共同起作用。近年來，隨著吸入性麻醉藥心肌保護機制研究逐漸深入，心肌細胞線粒體游離鈣離子成為吸入麻醉藥對心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷發(fā)揮保護作用潛在的下游靶點，Agarwal等［19］最新研究表明異氟醚通過抑制NCE介導了其對心肌IR損傷的保護作用。

丙泊酚對于鈣內流的影響至今存在爭議。早在1994年，Anders等［20］就采用Fura-2及單細胞熒光顯微鏡技術研究了丙泊酚對多種細胞［Ca2+］i影響，研究指出丙泊酚可以增加大鼠胚胎神經元細胞及人神經膠質細胞內鈣離子濃度，促進鈣內流。然而Kim等［21］指出丙泊酚可以對新生大鼠心室肌細胞的IR損傷起到保護性作用，這種作用一部分原因可能是通過抑制鈣內流降低鈣超載。國內也有文獻報道丙泊酚抑制了細胞的鈣內流［22］。筆者認為，造成差異的原因主要有以下幾點:其一，各實驗所選取的細胞種類不同，可以初步認為丙泊酚對不同種類的細胞Ca2+內流作用不同。丙泊酚由于抑制了心肌細胞鈣負載(Ca2+overload)從而發(fā)揮其對缺血/再灌注心肌的保護作用，但對神經元細胞的鈣內流起了雙向調節(jié)作用。其二，各實驗所選用的丙泊酚濃度不同。丙泊酚發(fā)揮心肌保護作用時的血漿濃度遠高于其發(fā)揮臨床麻醉作用的血漿濃度［21］。其它原因，如測定［Ca2+］i方法的差異，細胞處理方法的差異等。

2 鈣離子外流系統(tǒng)(calcium efflux system)

盡管受到多種因素的刺激后細胞內鈣離子濃度增加，但是細胞可以迅速的進行自我調整，以維持胞內較低的鈣離子濃度，這依賴鈣離子外流系統(tǒng)［23］。鈣離子外流系統(tǒng)主要包括胞質膜Ca2+-ATP酶、NCE、線粒體及內質網吸收鈣離子等。其中Ca2+-ATP酶占主導作用。

2.1 胞質膜 Ca2+-ATP酶(plasma memberane Ca2+-ATPase，PMCA)PMCA對鈣離子具有很強的親和力，主要負責在胞質游離鈣離子濃度較低時將內流入胞質的鈣離子通過電壓門控型鈣通道或脂質門控型鈣通道排除胞質外，以維持胞質低鈣離子濃度。相比之下NCE雖然具有較高的效能，但其對鈣離子親和力較低，主要負責胞質游離鈣離子濃度較高時(＞1 μmol·L-1)排出鈣離子。

許多文獻證明了PMCA在鈣離子負載時維持神經元胞質內低鈣濃度的重要性。早在1992年Benham等［24］證實在體外培養(yǎng)的鈣負載小鼠背根神經節(jié)細胞中，維持細胞內低鈣濃度的活動中NCE只占小部分，而PMCA占主要部分。隨后Drago等［25］評估了鈣離子外排系統(tǒng)后得出同樣結論:PMCA介導的鈣離子排出是在接受刺激后恢復細胞及線粒體內基礎鈣濃度的主要步驟。這些研究共同表明PMCA在恢復細胞內鈣離子濃度發(fā)揮了獨特的作用，而其它體系如NCE、線粒體、內質網在細胞內鈣離子少量增長時迅速排出過程中起的作用并不突出。

2.2 全身麻醉藥物對胞質膜Ca2+-ATP酶的作用 細胞內鈣離子濃度以及細胞興奮性的變化可以引發(fā)神經遞質釋放入突觸間隙，使得人們注意到全身麻醉藥物引起神經元PMCA變化也許是其發(fā)揮麻醉作用的潛在機制。2000年，Brennan等［26］通過電泳及免疫印記的方法證實隨著氟烷濃度的增加，骨骼肌PMCA的異構體SERCA1外在的單體數目被明顯抑制。同時指出氟烷在5 mmol·L-1及25 mmol·L-1濃度時PMCA異構體SERCA的活性分別降低27%及53%。隨后Kim等［21］采用RT-PCR方法研究維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的相關基因，研究表明與正常心肌細胞相比，IR細胞肌漿網Ca2+-ATP酶(SERCA2a)，L-型鈣通道及肌纖維膜上Ca2+泵(PMCA1)的基因表達都減少，其中SERCA2a轉錄水平最低。

3 細胞內鈣離子的儲存(intracellular calcium stores)

如前所述，對于鈣內流體系的相關研究有很多，相較之下關于細胞內鈣離子儲存系統(tǒng)內質網的研究偏少，但是內質網作為鈣離子的源泉其重要性不容忽視。內質網膜上含有三磷酸肌醇(1，4，5-trisphosphate，IP3)及 Ryanodine(RYD)受體，負責將儲存的鈣離子釋放入胞質。兩種受體都依賴于鈣觸發(fā)鈣釋放(Ca2+-induced Ca2+release)模式，受鈣離子負荷量及許多因子(如三磷酸肌醇IP3，二磷酸腺苷ADP)的調節(jié)［27］。外源信號作用于細胞外周的受體，使磷酸肌醇4，5-二磷酸水解產生第二信使(二酰甘油和IP3)。IP3彌散入細胞內，通過激動內質網上的IP3受體引發(fā)Ca2+釋放。RYD受體是最先發(fā)現的調節(jié)骨骼肌和心肌細胞肌漿網Ca2+釋放的受體?？煞譃镽YD1(骨骼肌)、RYD2(心肌)及新發(fā)現的RYD3(僅在腦，平滑肌和一些非興奮性組織中表達)。

已有研究表明，吸入性麻醉藥可以刺激多種細胞內質網IP3受體或RYD受體釋放Ca2+，如心肌、骨骼肌、血管平滑肌以及神經細胞。2001年Allansson等［28］將體外培養(yǎng)的初級星形膠質細胞急性暴露于乙醇中，發(fā)現乙醇可以通過激活細胞內鈣離子儲存系統(tǒng)從而增加［Ca2+］i。Dou等［29］通過記錄全細胞K(+)和Ca(2+)電流指出靜脈麻醉藥硫噴妥鈉所誘導的胰島素分泌是通過激活細胞內IP3敏感的鈣離子儲存系統(tǒng)，而并非由VGCC介導的鈣內流所控制。但是對于全身麻醉藥物影響內質網Ca2+離子釋放及神經元［Ca2+］i效應也存在爭議，全身麻醉藥物對細胞鈣離子儲存系統(tǒng)的影響仍需要進一步的研究。

鈣離子信號通路及其所影響的神經遞質的釋放為全身麻醉藥物作用機制的研究提供了方向和思路，通過十幾年的研究，也取得了很大的進展。然而正如前面所提到的，許多結論的相關依據并不充足，很多問題的研究仍存在爭議。在發(fā)揮心肌保護作用時的丙泊酚血漿濃度會對神經系統(tǒng)造成何種影響?吸入麻醉藥引起的［Ca2+］i增加的確切機制是內流增加還是外排減少?鈣儲存系統(tǒng)在［Ca2+］i增加中發(fā)揮了多大作用等相關問題需要我們對全麻機制相關的細胞內鈣離子動態(tài)變化及隨之引發(fā)的神經遞質釋放的變化進行更加深入的探討。

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