結(jié)腸癌化學造模方法研究進展

郭 蒙，葉 華，朱宇珍，吳 瓊，鄭學寶

(廣東醫(yī)學院1.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，2.藥理學教研室，廣東湛江 524023)

結(jié)腸癌是目前最常見的消化道惡性腫瘤之一。迄今，全球結(jié)腸癌發(fā)病率仍呈上升趨勢[1]，調(diào)查顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率分別為28.08/10萬和13.41/10萬，占惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第3位和第5位[2]，已成為嚴重影響人類健康的疾病之一。目前，實驗室研究結(jié)腸癌的造模方法大多數(shù)為移植瘤模型，選用無胸腺裸鼠，將腫瘤細胞或組織進行皮下移植或原位移植，此方法操作簡單，周期短，成功率高，但是不能觀察到結(jié)腸癌形成過程，發(fā)展狀況，轉(zhuǎn)移類別，且人類癌癥流行病學和實驗室癌癥動物模型研究均表明，化學致癌劑是誘導人類癌癥發(fā)生的重要因素之一。因此，結(jié)腸癌化學造模方法是研究結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤藥物療效的重要工具，對結(jié)腸癌化學造模方法的探討具有重要意義。

1 化學致癌劑的種類

使用化學致癌劑在動物上建立結(jié)直腸癌模型最早可追溯到20世紀50年代初期，Lorenz[3]報道用多環(huán)芳香烴化合物甲基膽蒽(methylcholanthrene)喂養(yǎng)的小鼠胃賁門部和腸道發(fā)生了腫瘤。1952年，Walpole等[4]發(fā)現(xiàn)給大鼠注射4-氨基聯(lián)苯和 3，2-二甲基-4-氨基聯(lián)苯(2，3'-dimethyl-4-aminobiphenyl，DMAB)可誘發(fā)大腸癌;1981年，日本學者將乙基硝基亞硝基胍(N-ethyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，ENNG)栓劑置入雜種犬肛門上15cm處的腸管進行結(jié)腸癌造模，13個月后發(fā)現(xiàn)潰瘍及腸腺底癌灶形成。1967年，Druckrey 等[5]通過 1，2-二甲肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)誘導出大鼠腸道癌癥。1999年，Delker等[6]用氧化偶氮甲烷(azoxymethan，AOM)在近交小鼠中誘導出腸癌。這些模型不夠成熟，造模成功率低。

隨著化學造模方法研究的深入，使用二甲肼和氧化偶氮甲烷及其代謝物甲基偶氮甲烷(methylazoxymethanol，MAM)作為致癌劑的造模方法越來越成熟，成為目前最為常用的化學致癌劑。除此外還有雜環(huán)氨類化合物，如2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑[4，5-b]嘧啶(2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine，PhIP)和 2-氨基-3-甲基咪唑[4，5-f]喹啉(2-amino-3-methylimidazo[4，5-f]quinoline，IQ);芳香胺類化合物，如3，2'-二甲基-4-氨基聯(lián)苯(DMAB);烷基亞硝酰胺類化合物，如甲基亞硝基胍(methylnitrosourea，MNU)和甲基硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)等。通過光鏡分析發(fā)現(xiàn)，這些致癌物誘導的包括腫瘤在內(nèi)的上皮病變與人類結(jié)腸癌的病變具有相似性。許多在人類結(jié)腸癌上發(fā)現(xiàn)的細胞和生化的異常指標都可以在結(jié)腸癌化學造模的動物上找到，如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝的異常，提高環(huán)氧酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)的活性和伴隨產(chǎn)物前列腺素E2的生成，改變鳥氨酸脫氫酶活性和聚胺的水平，上游調(diào)節(jié)多種促炎因子的生成[7]，故能夠基于人類結(jié)腸癌中異常表達的蛋白在結(jié)腸癌化學誘導的動物模型中研究抗癌靶向藥物。由此看出，致癌物誘導的動物模型能很好的模擬人類結(jié)腸癌。

氧化偶氮甲烷及二甲肼作為致癌劑，致癌效果佳，器官選擇性好。二者在大鼠上造成的結(jié)直腸癌跟人的十分相似，只是缺少人結(jié)直腸癌的前期腺瘤和后期易轉(zhuǎn)移的特征。早期的研究使用二甲肼誘導結(jié)直腸癌，重復(fù)性好，二甲肼經(jīng)肝代謝產(chǎn)生DNA烷化劑氧化偶氮甲烷。二甲肼和氧化偶氮甲烷為間接致癌劑，本身不致癌，必須經(jīng)過代謝氧化脫烷基成甲基偶氮甲烷才具致癌作用。與二甲肼相比，氧化偶氮甲烷表現(xiàn)出更強的致癌作用，且使用劑量穩(wěn)定，已經(jīng)成為經(jīng)典的致癌劑，應(yīng)用非常廣泛[8]。二甲肼在代謝中大部分隨尿排出體外，氧化偶氮甲烷則不會。在致癌的生物靶向性方面，相比二甲肼，氧化偶氮甲烷能專一趨向特異器官。氧化偶氮甲烷易誘發(fā)末端結(jié)腸癌，其病理學和遺傳學改變與人散發(fā)性結(jié)腸癌極其相似[9]。

各種致癌劑的致癌效果有所不同，其成瘤率主要取決于給藥途徑、頻率、劑量、持續(xù)時間以及生物的性別、遺傳背景、周齡等。同時飲食、腸道菌群、免疫狀態(tài)等可通過干擾致癌劑的代謝來影響局部有效濃度，影響致癌效果。

2 給藥途徑的比較

化學致癌物造模的效果與給藥途徑有密切聯(lián)系，表現(xiàn)為其誘發(fā)結(jié)腸癌的概率有顯著差異。據(jù)統(tǒng)計，大鼠口服二甲肼20 mg·kg－152周后發(fā)生結(jié)腸癌的概率為14%～30%;皮下注射氧化偶氮甲烷發(fā)生結(jié)腸腫瘤的概率為100%;直腸內(nèi)給二甲肼250 mg·kg－18周，在34周后發(fā)現(xiàn)結(jié)腸的輕微增生和癌前病變;每周肌內(nèi)注射氧化偶氮甲烷8 mg·kg－1，12周后發(fā)生結(jié)腸腫瘤的概率為80%[10]。每周腹腔注射氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1，連續(xù)4周，在第24周發(fā)生結(jié)腸癌的概率為100%[11]。后來研究人員又發(fā)現(xiàn)了MNU及MNNG等亞硝胺類化合物動物灌腸后能誘發(fā)大腸癌。直腸內(nèi)直接給予MNU后結(jié)腸癌的發(fā)生率為100%，并伴23%～31%的小鼠發(fā)生腫瘤的轉(zhuǎn)移[12]。PhIP與食物一同給予小鼠也有較好的致癌效果，400 mg·kg－1的PhIP在第52周可獲得55%的致癌率[13]，且PhIP的致癌效果與性別與種族有很大的聯(lián)系[14]。有報道中對二甲肼口服、皮下注射、胃內(nèi)埋線三種給藥方式進行了比較，發(fā)現(xiàn)皮下注射成瘤率較其他給藥方式高。但在A/J小鼠中，皮下注射氧化偶氮甲烷的效果不如腹腔注射的效果，而對于SER/J小鼠沒有此區(qū)別[6]，說明給藥途徑的成瘤效果跟小鼠的遺傳背景有密切聯(lián)系。近年研究較多且成瘤率高的給藥方式為腹腔注射，對不同劑量氧化偶氮甲烷的成瘤率和致死率進行比較，發(fā)現(xiàn)連續(xù)4周腹腔注射氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1為最佳的給藥劑量[6]。作者還指出，此最佳劑量與動物的飼養(yǎng)環(huán)境無關(guān)，劑量對實驗結(jié)果顯著的影響，劑量過高會導致動物死亡率升高，劑量過低會導致癌癥程度較輕，不同的致癌劑的最佳劑量取決于實驗動物遺傳背景和給藥方式，故需要試驗者進行摸索。

有報道指出，長期的西化食物(包括高脂肪、高熱量、低鈣、低維生素D)飼養(yǎng)小鼠18個月后，在小鼠的小腸和結(jié)腸發(fā)現(xiàn)較多腫瘤[15]。亦有很多研究者通過誘導結(jié)腸炎誘發(fā)結(jié)腸癌，Cooper等[16]用4%葡聚糖硫酸鈉造模，4 d的葡聚糖硫酸鈉加12 d的正常飲水為1個循環(huán)，1個循環(huán)和2個循環(huán)后的成癌率分別為22%和40%。結(jié)腸炎誘發(fā)結(jié)腸癌很好的模擬了人結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變，有很好的研究意義，但由于造模周期過長，成瘤率低，采用者少。

研究人員在此基礎(chǔ)上進行改良，先腹腔注射15 mg·kg－1二甲肼1 周，再飲用 20 g·L－1的葡聚糖硫酸鈉1周，第4周后發(fā)現(xiàn)40%小鼠便血，13周后10%小鼠脫肛，20周后40%小鼠脫肛，100%的雄性ICR小鼠出現(xiàn)結(jié)腸癌[17]。化學致癌劑和葡聚糖硫酸鈉的聯(lián)合應(yīng)用提高了致癌率，減少了誘導周期，而且可以觀察到結(jié)腸炎到結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)變過程，為較為理想的化學造模方案，適用于相關(guān)預(yù)防和治療藥物的研究，近年來被廣泛應(yīng)用。

3 實驗動物的選擇

小鼠的繁殖能力強，價格低廉，給藥劑量低，故結(jié)腸癌的實驗研究中多用小鼠作為實驗動物。實驗用小鼠有多種類型:近交系(BALB/C、C57BL、A 系、C3H/HE、DBA 等)、遠交系(KM、ICR、NIH、CFW、LACA 等)和突變系(NUDE、SCID、SAM等)。不同的小鼠由于遺傳背景不同故對致癌劑的敏感性不同，而對致癌劑的致癌效果產(chǎn)生很大影響。例如:A/J、P/J、STS/A和ICR/HA鼠對二甲肼的致癌作用高度敏感，BALB/CHEA和SWM/J鼠敏感性較弱，AKR/J和DBM/2J鼠則表現(xiàn)出相對的耐藥性[18]。A/J、SWR/J鼠對氧化偶氮甲烷有很強的敏感性。

有報道用氧化偶氮甲烷10 mg·kg－1對SWlR/J，A/J和AKR/J三種小鼠進行腹腔注射，每周1次，總計6周，發(fā)現(xiàn)AKR/J小鼠未誘發(fā)出大腸腫瘤，而另兩種小鼠則在第6周有大腸腫瘤形成[19]。相關(guān)的研究也指出，A/J小鼠有高度的結(jié)腸癌敏感性，SWIR/J小鼠其次，AKR/J小鼠對氧化偶氮甲烷的致癌作用有抵抗性。這些說明致癌劑的致癌效果跟實驗動物的遺傳背景有密切聯(lián)系，其中氧化偶氮甲烷作為腫瘤發(fā)生的激活劑，也能在一定遺傳背景的基礎(chǔ)上促進腫瘤的發(fā)生。

ICR小鼠接受一次腹腔注射氧化偶氮甲烷(10 g·kg－1)，1 周后，再飲用葡聚糖硫 20 g·L－1酸鈉 1 周，20周后發(fā)現(xiàn)成瘤率100%[20]。在4種近交系小鼠(BALB/C，C57BL/6N，C3H/HEN和DBA/2N)上使用這種造模方法，發(fā)現(xiàn)BALB/C小鼠與ICR小鼠有相同的作用，對氧化偶氮甲烷最敏感，C57BL/6N小鼠其次，而其他2種小鼠對氧化偶氮甲烷表現(xiàn)出一定的耐藥性[21]。證明了小鼠遺傳背景的不同能對致癌劑的致癌效果產(chǎn)生巨大的影響，作者還指出這是由于不同遺傳背景的小鼠在炎癥時期所具有的亞硝化能力不同多導致的。

分子生物學研究證實某些基因的突變或表達異常會導致結(jié)腸癌的產(chǎn)生，遺傳突變包括癌基因激活(K-Ras、C-myc、EGFR)、抑癌基因失活(APC、DCC、p53)、錯配修復(fù)基因突變(MMR、HLH1、PMS1、PMS2、GTBP)及危險修飾基因(COX-2、CD44v)。人類結(jié)腸癌主要的遺傳疾病包括遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，NHPCC)(5%～13%)和家族性腸息肉病 (1%)。隨著基因工程技術(shù)和分子生物學的發(fā)展，基因打靶和基因剔除技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因動物在實驗研究中得到了大力的發(fā)展。如APC基因突變系小鼠，p53基因敲除小鼠，IL-10基因敲除小鼠，Gαi2基因敲除小鼠等，轉(zhuǎn)基因小鼠有自發(fā)結(jié)腸炎與結(jié)腸癌的趨向，表現(xiàn)為多發(fā)性小腸息肉和結(jié)腸炎癥，在藥物或飲食干預(yù)下轉(zhuǎn)基因小鼠更易誘導出結(jié)腸癌。如APC min+/－小鼠給予4%DSS 4 d，然后正常飲水17 d為一個循環(huán)，4個循環(huán)后小鼠的腸成瘤率100%[22]。有學者給C57BL/6N小鼠遠端結(jié)腸注射帶有APC基因突變病毒，6周后71%的小鼠誘發(fā)了腺瘤，18周后4%的腺瘤發(fā)展為腸癌[23]。p53基因敲除小鼠給予4%葡聚糖硫酸鈉3個循環(huán)后結(jié)腸癌發(fā)病率為53.9%[24]。通過分子生物學的技術(shù)改變某些基因或干擾其表達，可達到良好的效果，在研究致癌基因方面有很強的優(yōu)勢，為結(jié)腸癌動物模型的研究開辟了一個嶄新的天地。

4 化學致癌劑導致癌變的機制

1979年，戴乾圜等提出化學致癌機理的雙區(qū)理論:環(huán)境致癌劑代謝成特定的雙官能烷化劑，并通過誘發(fā)DNA互補堿基交聯(lián)和股間交聯(lián)而啟動癌變。DNA互補堿基共價交聯(lián)啟動的突變，是化學致癌劑誘發(fā)癌變的第一步。他證實了化學致癌劑、物理致癌因子和內(nèi)源性致癌物質(zhì)均首先引起DNA互補堿基的交聯(lián)，而互補堿基的交聯(lián)可高效率地引起基因的起始突變即沿DNA雙股的點突變或移碼變異，然后起始突變經(jīng)歷潛伏期，受被激活的逆轉(zhuǎn)錄機制激發(fā)而實現(xiàn)細胞的深度突變即產(chǎn)生各種奇異染色體并引起細胞的癌變[25－26]。

人類的結(jié)腸癌，包括自發(fā)性結(jié)腸癌，致癌劑誘導的結(jié)腸癌，遺傳性非息肉性結(jié)腸癌，和結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌，每一種都受不同的分子通路主導調(diào)控，且伴有相關(guān)的基因突變，這些突變基因包括K-Ras、APC、p53和 β聯(lián)蛋白等[27]。化學致癌劑誘導的結(jié)腸癌實驗動物模型中有大量與人類相同的基因突變和遺傳通路的改變。Endo等[28]的研究指出，二甲肼誘導的結(jié)腸癌中有57%的K-Ras基因突變。在氧化偶氮甲烷誘導的結(jié)腸癌中，K-Ras基因突變頻率高，而APC和p53的突變頻率低[29]。相反，在PhIP、MNU和MNNG誘導的結(jié)腸癌中，其目標基因為APC和p53，K-Ras基因突變頻率低[13]。Wnt/APC/β聯(lián)蛋白信號通路在化學致癌劑誘導的結(jié)腸癌中有重要地位，且氧化偶氮甲烷、二甲肼、IQ和PhIP誘導的結(jié)腸癌中均有β聯(lián)蛋白基因的突變，β聯(lián)蛋白的表達異常與不典型增生和癌變有關(guān)?；瘜W致癌劑是通過引起特定基因的突變，細胞突變的積累過度最終達到致癌效果。

有學者在IL-10敲除和野生型小鼠上使用氧化偶氮甲烷刺激誘發(fā)結(jié)腸癌，發(fā)現(xiàn)只有基因敲除的小鼠有結(jié)腸癌的陽性表達，說明炎癥微環(huán)境在癌癥的發(fā)生發(fā)展上起重要作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)，癌前病變的微環(huán)境中伴有大量炎性細胞、炎性因子及趨化因子的浸潤，其浸潤程度與腫瘤惡性程度相關(guān)[31]。在實驗的研究中氧化偶氮甲烷增加結(jié)直腸瘤中COX-2的表達[32]，抑制腸上皮細胞轉(zhuǎn)錄生長因子β受體2的表達[8]，激活表皮生長因子的固有的酪氨酸激酶[33]，核轉(zhuǎn)錄因子κB作為多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子在炎癥與腫瘤之間也有重要的橋梁作用[34]，說明致癌劑在誘導結(jié)腸癌的過程中不同程度上刺激免疫系統(tǒng)，激活了炎癥反應(yīng)，從而在促進了癌癥的發(fā)生。

5 小結(jié)

由于結(jié)腸癌的發(fā)病率越來越高，在臨床上迫切的需要提高結(jié)腸癌的診斷指標，充分了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展的全過程，分析病因和尋找療效藥，解決各個階段病人的需要。化學造模方法能有效的模擬由腺瘤發(fā)展為惡性腫瘤的癌變過程，有利于研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的病理病機;基因重組、基因改造在模型上的應(yīng)用，有利于研究結(jié)腸癌相關(guān)的基因信息;能在不同遺傳背景的動物上進行結(jié)腸癌的復(fù)制，有利于研究腫瘤的化學預(yù)防和飲食因素，對結(jié)腸癌的研究有很好的推動作用。但結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與多種因素有關(guān)，要結(jié)合自身實驗的特點選擇適合的造模方法。盡管我們研究并應(yīng)用的化學致癌劑的種類、癌癥相關(guān)的基因有限，但隨著各種化學造模方法的應(yīng)用，結(jié)腸癌的深入研究，造模方法將得到完善，癌癥相關(guān)的基因?qū)⒗^續(xù)被發(fā)現(xiàn)，理想的治療藥物也會被找到。

[1]Jemal A，Bray F，Center MM，F(xiàn)erlay J，Ward E，F(xiàn)orman D.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90.

[2]Chen Q， Liu ZC， Cheng LP， Song GH，Sun XB，Zheng RS，et al.An analysis of incidence and mortality of colorectal cancer in China，2003－2007[J].China Cancer(中國腫瘤)，2012，21(3):179-182.

[3]Lorenz E，Stewart HL.Intestinal carcinoma and other lesions in mice following oral administration of 1，2，5，6-dibenzanthracene and 20-methylcholanthrene[J].J Natl Cancer Inst，1941，l(2):17-40.

[4]Walpole AL，Williams MH，Roberts DC.The carcinogenic action of 4-aminodiphenyl and 3:2'-dimethyl-4-amino-diphenyl[J].Br J Ind Med，1952，9(4):255-263.

[5]Druckrey H，Preussmann R，Matzkies F，Ivankovic S.Selective production of intestinal cancer in rats by 1，2-dimethylhydrazine[J].Naturwissenschaften，1967，54(11):285-286.

[6]Delker DA，Wang QS，Papanikolaou A，Whiteley HE，Rosenberg DW.Quantitative assessment of azoxymethane-induced aberrant crypt foci in inbred mice[J].Exp Mol Pathol，1999，65(3):141-149.

[7]Yoshimi N，Sato S，Makita H，Wang A，Hirose Y，Tanaka T，et al.Expression of cytokines，TNF-alpha and IL-1 alpha，in MAM acetate and 1-hydroxyanthraquinone-induced colon carcinogenesis of rats[J].Carcinogenesis，1994，15(4):783-785.

[8]Neufert C，Becker C，Neurath MF.An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammationdriven tumor progression[J].Nat Protoc，2007，2(8):1998-2004.

[9]Guda K，Giardina C，Nambiar P，Cui H，Rosenberg DW.Aberrant transforming growth factor-beta signaling in azoxymethane-induced mouse colon tumors[J].Mol Carcinog，2001，31(4):204-213.

[10]Kobaek-Larsen M，Thorup I，Diederichsen A，F(xiàn)enger C，Hoitinga MR.Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models:comparative aspects with those in humans[J].Comp Med，2000，50(1):16-26.

[11]Bissahoyo A，Pearsall RS，Hanlon K，Amann V，Hicks D，Godfrey VL，et al.Azoxymethane is a genetic background-dependent colorectal tumor initiator and promoter in mice:effects of dose，route，and diet[J].Toxicol Sci，2005，88(2):340-345.

[12]Yang J，Shikata N，Mizuoka H，Tsubura A.Colon carcinogenesis in shrews by intrarectal infusion of N-methyl-N-nitrosourea[J].Cancer Lett，1996，110(1-2):105-112.

[13]Shirai T，Tamano S，Sano M，Masui T，Hasegawa R，Ito N.Carcinogenicity of 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine(PhIP)in rats:dose-response studies[J].Princess Takamatsu Symp，1995，23:232-239.

[14]Sugimura T.Overview of carcinogenic heterocyclic amines[J].Mutat Res，1997，376(1-2):211-219.

[15]Newmark HL，Yang K，Kurihara N，F(xiàn)an K，Augenlicht LH，Lipkin M.Western-style diet-induced colonic tumors and their modulation by calcium and vitamin D in C57Bl/6 mice:a preclinical model for human sporadic colon cancer[J].Carcinogenesis，2009，30(1):88-92.

[16]Cooper HS，Everley L，Chang WC，Pfeiffer G，Lee B，Murthy S，et al.The role of mutant Apc in the development of dysplasia and cancer in the mouse model of dextran sulfate sodium-induced colitis[J].Gastroenterology，2001，121(6):1407-1416.

[17]Li YH， Liu L， Feng J， Wang QW，Sun Y，Cao W，et al.A novel model of colitis-related colorectal cancer[J].World Chin J Digestol(世界華人消化雜志)，2007，15(3):234-239.

[18]Rosenberg DW， Giardina C， Tanaka T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis[J].Carcinogenesis，2009，30(2):183-196.

[19]Papanikolaou A， Wang QS， PapanikolaouD， Whiteley HE，Rosenberg DW.Sequential and morphological analyses of aberrant crypt foci formation in mice of differing susceptibility to azoxymethane-induced colon carcinogenesis[J].Carcinogenesis，2000，21(8):1567-1572.

[20]Papanikolaou A， Wang QS， Papanikolaou D， Whiteley HE，Rosenberg DW.Sequential and morphological analyses of aberrant crypt foci formation in mice of differing susceptibility to azoxymethane-induced colon carcinogenesis[J].Carcinogenesis，2000，21(8):1567-1572.

[21]Suzuki R，Kohno H，Sugie S，Nakagama H，Tanaka T.Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice[J].Carcinogenesis，2006，27(1):162-169.

[22]Cooper HS，Murthy S，Kido K，Yoshitake H，F(xiàn)lanigan A.Dysplasia and cancer in the dextran sulfate sodium mouse colitis model.Relevance to colitis-associated neoplasia in the human:a study of histopathology，B-catenin and p53 expression and the role of inflammation[J].Carcinogenesis，2000，21(4):757-768.

[23]Hung KE，Maricevich MA，Richard LG，Chen WY，Richardson MP，Kunin A，et al.Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(4):1565-1570.

[24]Rutgeerts P，Diamond RH，Bala M，Olson A，Lichtenstein GR，Bao W，et al.Scheduled maintenance treatment with infliximab is superior to episodic treatment for the healing of mucosal ulceration associated with Crohn's disease[J].Gastrointest Endosc，2006，63(3):433-442.

[25]Dai QH.Di-region theory，new discovery on mechanism of carcinogenesis[J].Mol Eng，1998，8(1):69-81.

[26]Dai QH， Zheng QY， Wang ZY. Quantitative explanation on structure-carcinogenic relationship of aromatic amines by di-region theory[J].Sci China B，1991，34(5):547-559.

[27]Takahashi M，Wakabayashi K.Gene mutations and altered gene expression in azoxymethane-induced colon carcinogenesis in rodents[J].Cancer Sci，2004，95(6):475-480.

[28]Endo T，Ookawa K，Tanaka M，Nakaji S，Tsuchida S，Sugawara K.Differences in carcinogenesis by the length of carcinogen exposure period in rat colon[J].Dig Dis Sci，2001，46(1):109-117.

[29]Erdman SH，Wu HD，Hixson LJ，Ahnen DJ，Gerner EW.Assessment of mutations in Ki-ras and p53 in colon cancers from azoxymethane-and dimethylhydrazine-treated rats[J].Mol Carcinog，1997，19(2):137-144.

[30]Uronis JM，Mühlbauer M，Herfarth HH，Rubinas TC，Jones GS，Jobin C.Modulation of the intestinal microbiota alters colitis-associated colorectal cancer susceptibility[J].PLoS One，2009，4(6):e6026.

[31]McLean MH，Murray GI，Stewart KN，Norrie G，Mayer C，Hold GL，et al.The inflammatory microenvironment in colorectal neoplasia[J].PLoS One，2011，6(1):e15366.

[32]DuBois RN，Radhika A，Reddy BS，Entingh AJ.Increased cyclooxygenase-2 levels in carcinogen-induced rat colonic tumors[J].Gastroenterology，1996，110(4):1259-1262.

[33]Relan NK，Saeed A，Ponduri K，F(xiàn)ligiel SE，Dutta S，Majumdar AP.Identification and evaluation of the role of endogenous tyrosine kinases in azoxymethane induction of proliferative processes in the colonic mucosa of rats[J].Biochim Biophys Acta，1995，1244(2-3):368-376.

[34]Naugler WE，Karin M.NF-kappaB and cancer-identifying targets and mechanisms[J].Curr Opin Genet Dev，2008，18(1):19-26.