納米藥物免疫毒性研究進展

林 曼，洪 敏，王慶利，馬 璟

(1.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院國家上海新藥安全評價與研究中心，上海 201203;2.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100038)

納米藥物，目前尚無其準(zhǔn)確定義，可以理解為三維結(jié)構(gòu)空間中至少有一維處于納米尺度，即1～100 nm的藥物。因此，納米藥物的固有屬性為其具有介觀尺度，表面積大，這使得它具有一些特殊效應(yīng)，如相對于具有較大尺度的物質(zhì)，納米顆粒更容易進入生物體并相互作用。一旦進入生物體內(nèi)，粒徑大小又將影響納米藥物在生物體內(nèi)停留的部位和方式，進而決定吞噬細胞清除外源物質(zhì)的途徑。

納米藥物通過呼吸道經(jīng)肺進入機體后，不可避免地被肺組織中免疫細胞吞噬，引發(fā)免疫應(yīng)答，釋放細胞因子，引發(fā)上皮細胞炎癥[1]，未被吞噬清除的納米物質(zhì)可能逃過免疫系統(tǒng)的監(jiān)視積累在細胞質(zhì)或細胞核中[2]。進入生物體后，納米顆?？蓾B透細胞膜，穿透組織和淋巴結(jié)等，逃脫機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[3]。通過胃腸道吸收入血或直接進入血液的納米藥物，首先與血液中的蛋白質(zhì)結(jié)合，而后由多種細胞攝取并作用，導(dǎo)致免疫抑制或免疫增強等[4]。受顆粒性質(zhì)的影響，納米藥物可通過與特定的免疫細胞結(jié)合，或一定的攝取途徑，產(chǎn)生免疫刺激作用。傳統(tǒng)的低毒、無毒物質(zhì)在納米級別可能導(dǎo)致免疫毒性，如納米晶型石英和纖維可引發(fā)免疫毒性[5－6]。納米藥物特有的理化性質(zhì)也可使得納米顆粒與機體免疫系統(tǒng)之間存在特殊的相互作用，并參加催化、氧化、降解和裂解過程[7]。本文將從納米藥物的免疫學(xué)特性、不同類型納米藥物的免疫毒性及其研究方法3個方面進行綜述。

1 納米藥物的免疫學(xué)特性

納米藥物對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生增強或抑制的不同效應(yīng)，有可能導(dǎo)致不同的免疫毒性，如不良的免疫刺激、免疫抑制、超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病等。

1.1 免疫刺激

Gubbins等[8]就納米藥物對主要組織器官的免疫細胞的影響進行了系統(tǒng)的總結(jié)，包括上皮細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)和巨噬細胞。研究顯示，納米藥物被上述細胞攝取后，可激發(fā)不同的免疫通路，刺激炎癥物質(zhì)和細胞因子的產(chǎn)生和釋放。如γ－谷氨酸納米顆粒被DC攝取后，激活髓樣分化因子88介導(dǎo)的NK－κB信號通路，產(chǎn)生白細胞介素－12(interleukin－12，IL－12)p40 和 IL－6，活化抗原特異性的細胞毒T淋巴細胞，在脾細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的干擾素γ(interferon－γ，IFN－γ)，增加血清中抗原特異性 IgG1和IgG2的含量等[9]。此外，吸收入血的納米藥物可能通過刺激血液中補體系統(tǒng)、紅細胞和血小板，激活中性粒細胞，影響巨噬細胞的吞噬活性等[10]，從不同的免疫刺激方面引發(fā)免疫毒性。

1.1.1 抗原性

抗原性即刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的能力。碳60富勒烯納米粒是一種由碳原子組成的結(jié)構(gòu)，曾嘗試應(yīng)用于該類藥物設(shè)計。研究發(fā)現(xiàn)，碳60富勒烯納米粒可刺激多種實驗動物產(chǎn)生特異性抗體，這些特異性抗體由不同的IgG組成;后續(xù)研究表明，碳60富勒烯納米粒等可以通過特定機制影響其靶定位置，產(chǎn)生特異性抗體。碳70納米粒也可以產(chǎn)生類似抗體[11－12]。

1.1.2 佐劑特性

有些納米藥物可刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強、更快和更持久的免疫應(yīng)答。正在研究中的HIV2疫苗使用聚甲基丙烯酸甲酯納米顆粒替代傳統(tǒng)氫氧化鋁作為佐劑，發(fā)現(xiàn)聚甲基丙烯酸甲酯納米顆粒組小鼠產(chǎn)生的抗體比氫氧化鋁組和對照組高10～100倍，如IgG和IgM，高濃度抗體維持時間由10周延長至20周[13]。佐劑特性可能增強免疫刺激副作用，產(chǎn)生致命性過敏等，這也是非臨床研究中評價納米藥物免疫安全性的重要方面之一。

1.1.3 炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，納米藥物可通過多種通路影響炎癥反應(yīng)。Lutsiak等[14]報道，乙交酯－丙交酯共聚物(poly－D，L－lactic－co－glycolic acid，PLGA)納米顆粒可以改變小鼠對縮氨酸的免疫應(yīng)答。小鼠給予經(jīng)PLGA納米顆粒包裹的乙肝疫苗，對于縮氨酸和弗氏完全佐劑主要產(chǎn)生輔助性T細胞1(helper T cell 1，Th1)型免疫反應(yīng);直接給予藥物后主要為Th2型免疫反應(yīng)。此外，納米藥物可以加快DC的成熟，增加細胞CD80/CD86表達，刺激免疫系統(tǒng)，改變CD4+和CD8+細胞比例，影響炎癥反應(yīng)，引發(fā)不同程度的免疫毒性。

1.2 免疫抑制

免疫抑制表現(xiàn)在T和B細胞增殖減少及免疫器官功能降低等。第3.5代聚合物聚酰胺－胺型樹枝狀高分子屬于固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)，可以抑制Toll樣受體4，抑制DC和巨噬細胞合成的促炎性趨化因子和細胞因子，增加 CD25，CD80，CD83和 CD86的表達，可應(yīng)用于抑制瘢痕形成，益于術(shù)后恢復(fù)，將手術(shù)的長期成功率從30%增加到80%[15]。

2 納米藥物及其對免疫系統(tǒng)的影響

2.1 納米脂質(zhì)體

納米脂質(zhì)體是指在納米級別的、由一層或多層的雙層兩性磷脂分子包裹一種或多種水溶性物質(zhì)的脂質(zhì)體[16]。納米脂質(zhì)體顆粒表面電荷可影響對免疫系統(tǒng)的作用。Nakanishi等[17]發(fā)現(xiàn)，在包裹相同濃度抗原的條件下，與呈中性和陰性納米脂質(zhì)體相比，帶陽性電荷的納米脂質(zhì)體能更有效地誘導(dǎo)抗原特異性細胞毒T淋巴細胞反應(yīng)和遲發(fā)性超敏反應(yīng);陽性納米脂質(zhì)體藥物可以更有效的進入巨噬細胞和抗原遞呈細胞，產(chǎn)生I型MHC細胞，誘導(dǎo)細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

2.2 多聚納米粒

多聚納米粒是由可降解的高分子物質(zhì)、聚合物和膠團組成。在疫苗組分中，通常采用可降解的高分子物質(zhì)包裹抗原，刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。以PLGA為例，其生物降解的給藥系統(tǒng)有很多優(yōu)勢，如持續(xù)釋放藥物，在苛刻的環(huán)境中保護包裹的抗原，防止酶類的降解，使給藥具有靶向性且可以與配體結(jié)合，有佐劑效應(yīng)，提高生物利用度等。多聚納米粒普朗尼克是聚丙二醇與環(huán)氧乙烷的加聚物，Reddy等[18]在研究納米藥物疫苗時發(fā)現(xiàn)，小分子普朗尼克(≈25 nm)可以穩(wěn)定、高效地進入毛細血管或淋巴管，在DC中作用而后蓄積;而稍大顆粒的普朗尼克(≈100 nm)作用效率則只有小分子的10%，提示納米藥物對小鼠體液免疫和細胞免疫的影響可能與粒徑大小有相關(guān)性。

2.3 納米乳劑

納米乳劑為納米級乳滴。納米乳劑可用于疫苗，如乙肝疫苗nano－HBsAg是帶有重組肝炎病毒表面抗原的400 nm油包水型納米乳劑，可誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生細胞因子和趨化因子，刺激細胞產(chǎn)生IgG和黏膜IgA抗體，且免疫應(yīng)答反應(yīng)強烈;與傳統(tǒng)氫氧化鋁疫苗相比，其抗體產(chǎn)生量更多，刺激產(chǎn)生抗體的時間更長，更穩(wěn)定。制成納米乳劑后可透過鼻黏膜給藥，半衰期更長，熱穩(wěn)定性好，克服了乳化劑本身對溫度不穩(wěn)定的缺陷，優(yōu)化了儲存條件和給藥方式[19]。此藥物在美國已進入Ⅰ期臨床試驗。

2.4 固體脂質(zhì)納米粒

SLN是以固態(tài)的天然脂質(zhì)或合成的類脂等為載體包裹藥物制成的納米載藥系統(tǒng)。Feliu等[22]分析了多種SLN的納米藥物毒性，用人巨噬細胞和粒細胞及嚙齒類巨噬細胞等4種以上的細胞進行體外實驗，從細胞毒性、細胞對納米藥物攝取以及細胞因子釋放等方面對納米藥物毒性進行了研究。研究結(jié)果表明，巨噬細胞對SLN的攝取減慢，導(dǎo)致其在血液循環(huán)時間延長，進而降低毒性，增加耐受性;不同的脂質(zhì)載體和不同的濃度可產(chǎn)生不同的免疫效應(yīng)，SLN載體山崳酸甘油酯納米顆粒的實驗結(jié)果表明，高劑量組BALB/c小鼠脾出現(xiàn)組織病理改變，停藥6周后恢復(fù)，分析可能與納米藥物在小鼠體內(nèi)沉積、生物分布廣及代謝較慢有關(guān)。

通過研究設(shè)計不同類型的納米藥物以得到所需的免疫效應(yīng)，可用于疫苗和抗腫瘤免疫增強作用，避免其副作用或不期望的免疫效應(yīng)。如Pan等[21]在研究抗腫瘤藥物時發(fā)現(xiàn)，納米脂質(zhì)性包裹的抗腫瘤藥物G3139，可增加藥物本身導(dǎo)致的IL－6和IFN－γ等細胞因子的釋放，促進 NK細胞和DC增殖，提高抗腫瘤效應(yīng)。

3 納米藥物免疫毒性的研究方法

已知納米藥物的毒性與其特有的理化性質(zhì)相關(guān)，但尚無明確的以結(jié)構(gòu)相關(guān)為基礎(chǔ)的毒理學(xué)研究[22]。納米藥物的毒性研究仍然著重case－by－case原則。加之免疫系統(tǒng)是由多個免疫器官、免疫細胞和免疫分子構(gòu)成的復(fù)雜系統(tǒng)，因此，體內(nèi)實驗需要從不同免疫器官和細胞因子著手，關(guān)注動物整體的血液學(xué)、生物化學(xué)和免疫器官組織病理學(xué)等變化。

3.1 細胞實驗

通過對不同免疫細胞的細胞毒性測試，可檢測納米藥物對細胞半數(shù)致死濃度、免疫細胞增殖和分化等方面的影響。

Shaw等[23]采用不同的實驗方法、細胞類型和濃度系統(tǒng)地評價了50多種納米材料，旨在提供廣泛的納米藥物作用機制，如細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生釋放及特異性抗體的產(chǎn)生等，為預(yù)測納米材料毒性并進行毒性分級提供實驗數(shù)據(jù)。此外，體外三維實驗方法可模擬體內(nèi)細胞的反應(yīng)，如Huh等[24]建立了“芯片中的肺(lung－on－a－chip)”的方法，重建人類肺泡復(fù)雜完整的微環(huán)境;并應(yīng)用于研究納米硅顆粒經(jīng)上皮細胞和內(nèi)皮細胞攝取、循環(huán)及發(fā)生炎癥的機制。實驗發(fā)現(xiàn)，在lung－on－a－chip的實驗中，納米硅顆?？烧T發(fā)人肺泡上皮細胞炎癥因子表達增加，中性粒細胞停留在上皮細胞并累積，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致免疫毒性等。

3.2 細胞因子

細胞因子如白細胞介素和腫瘤壞死因子的合成釋放與正常相比的增加或減少均可用于評價免疫毒性。如Lucarelli等[2]在比較研究納米顆粒免疫毒性時發(fā)現(xiàn)，SiO2，TiO2和ZrO2納米顆?？蓪?dǎo)致IL－1β，腫瘤壞死因子α和IL－1α表達增加或減少，產(chǎn)生不同的免疫毒性。細胞因子含量可以通過ELISA測定。

3.3 毒理組學(xué)研究

除了常規(guī)的體內(nèi)外實驗，組學(xué)技術(shù)為研究納米藥物免疫毒性研究提供了新的技術(shù)和方法。納米碳管是由碳原子組成的立體結(jié)構(gòu)的納米材料，和納米富勒烯碳一樣，曾用于研究納米藥物載體并開發(fā)用于癌癥治療，但研究中發(fā)現(xiàn)對不同動物不同器官有細胞毒性，產(chǎn)生特異性抗體，導(dǎo)致免疫反應(yīng)。Ding等[25]將人成纖維細胞暴露于納米碳管后，進行全基因組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)暴露多壁納米碳管的細胞均有不同基因和基因表達量的改變，在表達譜中表達增多的主要是與抗病毒免疫應(yīng)答有關(guān)的人類黏病毒流感抗性基因1和2小鼠及與自身免疫改變有關(guān)的干擾素誘導(dǎo)蛋白1(interferon－induced protein with tetratricopeptide repeats，IFIT1)，IFIT2 和 IFIT3，表明納米藥物可以從基因水平影響動物免疫系統(tǒng)。Haniu等[26]通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法辨別多壁納米碳管暴露下多種蛋白質(zhì)合成，包括熱激蛋白、中性α糖苷酶和DNA錯配修復(fù)蛋白Msh2等，這些蛋白質(zhì)都可能影響免疫系統(tǒng)在內(nèi)的生物系統(tǒng)，表明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在納米藥物的免疫毒性評價中有重要的應(yīng)用價值。

3.4 其他

免疫表型分析、T細胞依賴性抗體反應(yīng)、NK細胞活性分析、巨噬細胞/中性粒細胞功能和細胞免疫分析法等都是測試特定細胞的數(shù)目、表型、活性和功能用以評價納米藥物免疫毒性的方法[26]。遲發(fā)型超敏反應(yīng)用淋巴結(jié)增殖實驗評價，納米藥物經(jīng)皮下注射后，可以通過淋巴結(jié)進入淋巴系統(tǒng)，第7天注射[3H](胸腺嘧啶核)苷，通過淋巴結(jié)細胞增殖判斷是否誘發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。皮下注射的納米藥物可以進入不同淋巴結(jié)，由DC攝取遞呈后，產(chǎn)生共刺激分子和Ⅱ型主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，進而產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

CH50補體激活實驗測定補體激活功能，補體激活導(dǎo)致血清中補體成分減少，降低裂解紅細胞的能力，從而測得補體激活能力的大小，測得納米藥物的免疫毒性。補體激活的免疫系統(tǒng)可以激活其他免疫細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生潛在的免疫毒性[17]。

不同物種對納米藥物的免疫毒性反應(yīng)不同，如補體激活實驗采用靈長類動物恒河猴或斑馬魚胚胎模型研究納米藥物的免疫毒性更加方便。無論體內(nèi)體外實驗，納米藥物免疫毒性研究仍需要以組織病理學(xué)檢查為“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，在組織病理學(xué)驗證的基礎(chǔ)上，通過檢測免疫系統(tǒng)的不同器官、組織和細胞等可以全方位的評價納米藥物的免疫毒性。

4 展望

納米技術(shù)作為新型藥物遞送系統(tǒng)，可能會實現(xiàn)靶向給藥，改善吸收，延緩藥物釋放，延長藥物作用時間，減少藥物在胃腸道代謝，提高生物利用度，并降低不良反應(yīng)。目前該類制劑多處于體外及動物體內(nèi)實驗階段，雖然部分藥物已進入臨床試驗，但上市品種很少，可能源于納米制劑給藥后仍有一些非預(yù)期的生物機體反應(yīng)。納米藥物開發(fā)需重視立題，考慮臨床需求，同時對其藥代動力學(xué)、安全性和有效性等進行全面評估，納米藥物的非臨床評價需要結(jié)合藥學(xué)處方工藝和質(zhì)控來考慮，其中免疫毒性是其中重要內(nèi)容之一。

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