惡性瘧原蟲AMA－1基因多態(tài)性研究進展

周銀發(fā)，張山鷹

2.福建省疾病預(yù)防控制中心，福州 350001

瘧疾是一種重要的蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶、亞熱帶以及溫帶部分地區(qū)。由于抗藥性蟲株和抗殺蟲劑按蚊的出現(xiàn)和蔓延，傳統(tǒng)的控瘧方法效果趨降。疫苗可能是有效的方法，所以疫苗的研發(fā)成為控制瘧疾的重要策略。裂殖子頂端膜抗原1（AMA－1）是惡性瘧原蟲的重要疫苗候選抗原之一，在入裂殖子侵紅細胞過程中起著重要作用［1］。

1 AMA－1的分子結(jié)構(gòu)及其作用

惡性瘧原蟲AMA－1基因全長大約有1 701 bp，編碼約600個氨基酸［2］。AMA－1在裂殖子晚期破裂前大量合成，最早是出現(xiàn)于裂殖體的微線體和棒狀體的頂端復(fù)合物上，隨著裂殖體的破裂，并非所有的AMA－1都遷移到裂殖子表面，而是一部份AMA－1蛋白酶降解加工進而遷移到裂殖子表面，另一部分未加工的AMA－1仍處于頂端復(fù)合物中［3］。AMA－1這部分的酶解加工可能與裂殖體破裂和裂殖子穩(wěn)定性有關(guān)。雖然AMA－1在瘧原蟲入侵人類細胞中起到重要作用，但卻沒有在瘧原蟲入侵后形成的環(huán)狀體中發(fā)現(xiàn)它，提示有可能AMA－1只是作為一種類似信號肽的作用［4］。AMA －1可能是瘧原蟲侵入紅細胞時與紅細胞膜結(jié)合的配體蛋白結(jié)合［5］。

AMA－1蛋白是一個83KD的完整跨膜蛋白，含有兩個疏水區(qū)域，一個是由胞質(zhì)區(qū)域靠近C－末端的55個氨基酸組成；第二個是由靠近N－末端的疏水區(qū)域，可能有類似信號肽的作用。AMA－1由3個區(qū)域組成，分別是由21個疏水氨基酸殘基組成的跨膜區(qū)、胞膜內(nèi)的55個氨基酸殘基構(gòu)成的胞內(nèi)區(qū)和處于N末端到跨膜區(qū)之間的胞外區(qū)（546個氨基酸殘基）組成的［6］。

惡性瘧原蟲的AMA－1蛋白，在胞外區(qū)含有17個相對保守的半胱氨酸殘基，除了最N端的那個半胱氨酸殘基外，其余的16個形成了8對分子內(nèi)的二硫鍵，這8個二硫鍵對AMA－1蛋白的三維結(jié)構(gòu)以及因其產(chǎn)生的特異性免疫保護反應(yīng)起到重要作用。而且基于這些二硫鍵可將胞外功能區(qū)分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個次級的功能區(qū)，分別含有3對，2對和3對二硫鍵［7］。

3個區(qū)域均是抑制性抗體的目標區(qū)域，所以外功能區(qū)的多態(tài)性對疫苗抗原的組成有很大的影響。有很多研究都針對該區(qū)域進行分析，其中很多研究都表明在外功能區(qū)甚至AMA－1全長中Ⅰ區(qū)是最具有多態(tài)性的，而Ⅱ區(qū)就相對比較保守一點［8－9］，但也有研究表示在Ⅱ區(qū)具有最多的氨基酸替代，表明Ⅱ區(qū)可能是最具多態(tài)性的一個區(qū)域［2］。雖然只有較少的突變發(fā)生在Ⅲ區(qū)，但是潛在的多態(tài)性也可能造成瘧原蟲逃脫抗體的作用。3個區(qū)域之間有著相互的作用，這相互作用是否對疫苗的發(fā)展有用還需進一步研究。

2 AMA－1基因多態(tài)性研究

2.1B T細胞抗原表位多態(tài)性 B T細胞抗原表位在AMA－1致免疫過程中起到重要作用，其抗原多態(tài)性在對疫苗的抗原成分有很大的影響。在AMA－1上有9個具有致免疫B T細胞抗原表位，其中有5個B細胞抗原表位和4個T細胞抗原表位，對這些表位均具有多態(tài)性，且除了胞質(zhì)尾區(qū)的571－588殘基上的一個T細胞抗原表位外其他均是非同義突變數(shù)量多于同義突變［8］；Rajesh［2］等同樣也對印度分離株該9個抗原表位中的8個分析發(fā)現(xiàn)比以往的報告中的結(jié)果更具有多態(tài)性而且還發(fā)現(xiàn)一些新的突變；Chenet［10］等在惡性瘧原蟲秘魯分離株的兩個致免疫的B T細胞抗原表位的（259－271）和（279－287）區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)在267位點（Glu－Gln）和282位點（Ile－Lys）有兩個均是非同義突變。

2.2 等位基因家族分類 AMA－1基因編碼的蛋白質(zhì)，它的氨基酸替代呈簇狀，聚集在成熟的AMA－1的第1個和第8個半胱氨酸之間（148－337殘基位置）Marshall［11］等發(fā)現(xiàn)53個突變位點中有24個（45%）處于該區(qū)域，該區(qū)域就是所謂的AMA－1的高度可變區(qū)域（HVR）。HVR最早是由Thomas等提出的位于AMA－1基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸160－210區(qū)域；Honder則認為HVR是屬于外功能Ⅰ區(qū)的一大部分，也有認為HVR與外功能Ⅰ區(qū)只是有重疊部分。HVR的研究區(qū)域逐漸變大，擴大到138－307區(qū)域［10］，到目前屬于148－337區(qū)域［12］。

基于 HVR，Marshall［11］等采用 PCR－RFLP方法將AMA－1等位基因分為4個家族Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ；Eisen［12］等同樣用該方法將惡性瘧原蟲的KF1916分離株消化成兩個次級等位基因分別屬于Ⅰ、Ⅱ家族；在對惡性瘧原蟲的非洲分離株的研究中也只發(fā)現(xiàn)有屬于前三個家族的等位基因作者認為第四個家族的等位基因并不存在于非洲［13］，在秘魯?shù)姆蛛x株中發(fā)現(xiàn)3個家族［10］，在印度分離株中只發(fā)現(xiàn)2個家族［14］。

但是也有對AMA－1的完整序列數(shù)據(jù)分析卻不能將等位基因劃分成幾個家族，認為基因家族分類使用于一些特殊情況如一些本身就已經(jīng)有明顯的分組的等位基因如 MSP－1和 MSP－2基因等。因為PCR－RFLP方法適用于嚴格的突變位點，而對于AMA－1散在的點突變并不適合［14］。Rajesh［2］在研究中也發(fā)現(xiàn)如果按Marshall的等位基因家族分類法，有兩個等位基因不屬于任何一個家族。因此這種采用PCR－RFLP方法對AMA－1等位基因進行分類的方法還需要進一步的研究。

2.3 AMA－1基因在地域上的差異 對AMA－1基因在地域上的差異的研究可以幫助我們了解蟲株的進化衍生，而地域上的差異對于疫苗的研發(fā)推廣是一種很重要的障礙。

2.3.1 對亞洲地區(qū)進行的研究 2007年Gargs等對印度的5個地區(qū)157例分離株分析其中有44個位點具有多態(tài)性產(chǎn)生了57種不同的單倍型，只有31種是單個拷貝，其中46種單倍型是以前沒有報道過的，且每個地區(qū)存在的單倍型都不一樣，在瘧疾高流行區(qū)域Ⅰ區(qū)多態(tài)性程度要比低瘧區(qū)來的高。整個Ⅰ區(qū)的152個密碼子29個突變位點中有17個位點是三態(tài)的，3個位點是四態(tài)的，1個是五態(tài)的，其中13個多態(tài)位點具有特定區(qū)域的多態(tài)性［8］。2008年Rajesh［2］等對印度的拉賈斯坦和孟加拉省的13例惡性瘧原蟲分離株序列分析結(jié)果與原型等位基因3D7和FC27比較，發(fā)現(xiàn)有161個突變位點，其中131個是非同義突變；54個是發(fā)生在密碼子的第一個堿基，49個發(fā)生在第二個堿基上，58個發(fā)生在第三個堿基上，改變了AMA－1蛋白氨基酸從而導(dǎo)致多態(tài)性的發(fā)生，氨基酸改變數(shù)量要比2001年Escalant［8］等對印度（德里）的分離株研究發(fā)現(xiàn)的54個氨基酸改變要多53個，并且在107個氨基酸改變中有32個位于Ⅱ區(qū)，這與Rajesh等在2007年對間日瘧原蟲研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似，Gunasekera也發(fā)現(xiàn)在間日瘧中有大部分單核苷酸多態(tài)位點聚集在Ⅱ區(qū)。

Quang［15］等對越南（Bao Loc）的惡性瘧原蟲分離株進行序列分析，分析的31個序列中有25個單倍型，大部分單倍型只有一個，有4個單倍型兩個拷貝，只有一個是三個拷貝，有37個多態(tài)位點，40個核苷酸多態(tài)位點，有三個多態(tài)位點是三態(tài)型，只有一個核苷酸多態(tài)是由同義突變引起的，在該地區(qū)的AMA－1基因核苷酸多態(tài)性程度要比尼日利亞、泰國和斯里蘭卡這些瘧疾流行區(qū)域要來的高。

單志新等［16］對惡性瘧原蟲海南（FCC1/HN）株AMA－1基因進行序列分析和同源性比較，與其他分離株相比并無長度多態(tài)性，與Thai－Tn和HB3株的同源性較高，而與張龍興等［17］報道的云南勐捧CMP1株差異較大，可能與惡性瘧原蟲FCC1/HN株與CMP1株存在地理隔離，彼此獨立進化有關(guān)。張龍興等對云南勐捧CMP1株序列分析與參照序列比較，有17個突變位點引起15個密碼子的變異，造成14個氨基酸的取代。HAN等［18］在南韓在出現(xiàn)的間日瘧原蟲分析發(fā)現(xiàn)AMA－1的兩個基因型與中國的基因型相似，推斷這些重現(xiàn)的瘧疾可能起源于中國或其他亞洲有出現(xiàn)類似該基因型的地區(qū)。

2.3.2 在對非洲以及南美洲人地區(qū)的研究：Chenet等在對秘魯亞馬遜流域的139例分離株研究發(fā)現(xiàn)的惡性瘧原蟲多態(tài)在其他南美洲地區(qū)均可發(fā)現(xiàn)，越早收集的分離株的基因多態(tài)性越高，有三個等位基因型3D7、perul和7GB，其中3D7出現(xiàn)的頻率最高，在全部的DⅠ區(qū)域中發(fā)現(xiàn)有24個多態(tài)位點，其中只有一個是發(fā)生同義替代。

Soulama等［13］在對惡性瘧原蟲非洲的分離株進行序列分析發(fā)現(xiàn)有三個等位基因型（K1、HB3和3D7），其中3D7的比例在非洲的東西中部存在差異（P＜0.05）。Esclante等在研究中發(fā)現(xiàn)位于非洲的肯亞分離株AMA－1基因是最具多態(tài)性，其多態(tài)位點要比東南亞多20%，比委瑞內(nèi)拉多30%。作者推斷造成非洲地區(qū)的AMA－1多態(tài)性程度比其他地區(qū)來的高有兩個主要原因：一是由于選擇壓力和地區(qū)的種群大小不同；二是由于惡性瘧原蟲是發(fā)源于非洲然后在東南亞衍生，而在南美州則遭遇在衍生殖民化進程中的瓶頸［8］。

2.4 造成AMA－1基因多態(tài)性的原因 造成惡性瘧原蟲AMA－1基因多態(tài)性原因，認為主要有三種：一是由于自然選擇引起；二是由于基因內(nèi)重組產(chǎn)生的；再則就是由于二者共同的作用下造成。

2.4.1 由自然選擇引起的 在對AMA－1突變位點分析中發(fā)現(xiàn)非同義突變率比同義突變率高是自然選擇的結(jié)果，從而產(chǎn)生基因多態(tài)性。張龍興等［1］對云南勐捧分離株分析發(fā)現(xiàn)非同義突變比同義突變率高，且有14個密碼子的突變均造成氨基酸的取代，一些取代還呈多發(fā)趨勢反映了惡性瘧原蟲AMA－1在選擇壓力下的進化現(xiàn)象；Oliveira等［19］認為非同義的堿基突變引起氨基酸替代的趨勢也表明了基因正經(jīng)歷著選擇的壓力；Esclante等［8］研究分析發(fā)現(xiàn)AMA－1的致免疫區(qū)域在選擇的壓力下產(chǎn)生高的多態(tài)性；Rajesh等［2］對惡性瘧原蟲的印度分離株也發(fā)現(xiàn)了d N/dS＞1認為自然的選擇是造成AMA－1多態(tài)性的主要原因；Chenet等［10］不僅在（259－271）R1和（279－287）R2區(qū)域還在其他區(qū)域發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點的突變都是非同義突變居多，他們認為正是由于該基因在特異性免疫反應(yīng)的選擇壓力下產(chǎn)生的非同義突變；Umar Faroop等［14］采用 PCR－RFLP方法未發(fā)現(xiàn)有次一級的等位基因從而無法進行基因家族的分類可能由于多態(tài)性存在自然選擇的原因；Coley等［20］也發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)的選擇壓力對AMA－1分子多態(tài)性起到很重要的作用。

2.4.2 由基因內(nèi)重組引起的 基因內(nèi)重組在MSP－1和MSP－2中已被認為是產(chǎn)生基因多態(tài)性的一個機制，可能也是AMA－1基因多態(tài)性的一個原因。而重組參數(shù)（Rm與R）被認為可以用來估計是否有重組的存在。Eisen［12］等采用PCR－RFLP方法對巴布亞新幾內(nèi)亞的惡性瘧原蟲的KF1916株分析發(fā)現(xiàn)有屬于Ⅰ和Ⅱ兩個家族的次級等位基因，提示有基因內(nèi)重組現(xiàn)象的存在。但該發(fā)現(xiàn)也僅限于在HVR上的嚴格的位點上進行，然而Escalante等［8］用Rm與SSCF測量方法均未發(fā)現(xiàn)有基因內(nèi)重組的存在。在理論上，當由于基因內(nèi)重組造成等位基因多態(tài)性時，在多態(tài)位點之間的基因連鎖不平衡程度就會下降；所以當我們用重組參數(shù)來估計基因內(nèi)重組是還要考慮兩個連鎖不平衡的指數(shù)（D’和R2）［15］。因此基因內(nèi)重組是否是造成AMA－1基因多態(tài)性的主要原因還需進一步研究分析。

2.4.3 由二者共同作用引起的 Garg［8］等研究的結(jié)果也闡明了AMA－1的外功能Ⅰ區(qū)的多態(tài)性是由于正向自然選擇導(dǎo)致的，但是重組參數(shù)（Rm和R）都很高說明了該區(qū)的一些多態(tài)位點可能有基因內(nèi)重組的存在。也對惡性瘧原蟲越南分離株研究中也發(fā)現(xiàn)d N/dS＞1的同時Rm值也比較高。這些都說明了有可能AMA－1基因多態(tài)性可能就是由于二者共同作用下引起的。

3 存在問題

AMA－1作為一種重要的瘧疾疫苗候選抗原，雖然對它的研究已取得很大的進展，但是仍有一些許多問題，例如：

3.1 在AMA－1內(nèi)的的16個保守的半胱氨酸殘基，在分子內(nèi)形成8個二硫鍵對瘧原蟲的AMA－1蛋白的穩(wěn)定性具有重要的作用。而半胱氨酸殘基的多態(tài)性對AMA－1成為瘧疾疫苗候選抗原的影響還需進一步的探討。

3.2 在一些研究中還發(fā)現(xiàn)了AMA－1在表達過程中由于突變而出現(xiàn)提前終止的現(xiàn)象［2］，這種現(xiàn)象對惡性瘧原蟲的生活史以及進化的影響，亦需進一步的分析。

3.3 AMA－1是惡性瘧原蟲最重要的疫苗候選抗原之一，但是由于等位基因的多態(tài)性而造成一些抗原表位的多態(tài)性，這些多態(tài)性阻礙了基于該抗原的疫苗研發(fā)，所以如何去尋找到有效的合適的抗原表位來研發(fā)廣譜而有效的疫苗仍是個關(guān)鍵問題。

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