超聲靶向破壞微泡技術(shù)在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

王 龔 卓忠雄

目前，我國(guó)對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療方法主要有手術(shù)、放療、化療和生物靶向治療等，化療是腫瘤綜合治療中最常用的手段，其效果主要取決于藥物在腫瘤局部的濃度與作用時(shí)間，系統(tǒng)化療時(shí)藥物進(jìn)入人體，聚集于腫瘤局部的藥物濃度低，維持有效藥物濃度時(shí)間短，而全身血液循環(huán)中藥物濃度相對(duì)較高，易引起毒副作用[1]。如何在保證最佳抗腫瘤效果的同時(shí)避免嚴(yán)重毒副作用的發(fā)生一直是臨床醫(yī)學(xué)上的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

近年來(lái)，隨著超聲造影劑研制工藝的進(jìn)展和超聲影像技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛使用，超聲靶向破壞微泡（ultrasoundtargeted microbubble destruction, UTMD）技術(shù)在腫瘤治療學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，UTMD技術(shù)可以明顯降低超聲在組織或器官引發(fā)空化效應(yīng)的閾值，空化效應(yīng)可以輔助多種藥物分子、目的基因進(jìn)入腫瘤組織增強(qiáng)相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[2,3]。本文就UTMD技術(shù)在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用及相關(guān)機(jī)制作一綜述。

1 UTMD技術(shù)的相關(guān)機(jī)制

UTMD技術(shù)是指在特定部位發(fā)射不同聲強(qiáng)的超聲波，當(dāng)超聲強(qiáng)度足夠大時(shí)血液中的微泡發(fā)生破裂，通過(guò)產(chǎn)生微射流、沖擊波使周?chē)难鼙诨蚣?xì)胞膜表面出現(xiàn)可逆的或不可逆的穿孔，使血管內(nèi)皮屏障損傷，進(jìn)而增加血管通透性，增加外源性物質(zhì)到達(dá)特定部位的劑量，從而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[4,5]。UTMD技術(shù)有3個(gè)特點(diǎn)：①安全性，超聲造影劑是一種高濃度的微氣泡混懸液，對(duì)人體無(wú)毒副作用；②靶向傳輸?shù)奶匦?，在靶向部位給予一定功率的超聲輻照（包括較高機(jī)械指數(shù)的診斷超聲），微泡破裂，釋放所攜帶的藥物或基因；③促滲透或轉(zhuǎn)移的作用，微泡破裂產(chǎn)生空化效應(yīng)，包括聲孔效應(yīng)、微射流等使微血管或細(xì)胞的通透性一過(guò)性升高，可以促進(jìn)藥物或基因的滲透[6]。

超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)血液中藥物或基因轉(zhuǎn)染的機(jī)制可能包括：①微泡在較高強(qiáng)度超聲的輻照下不斷振動(dòng)、膨脹、收縮，發(fā)生破裂，由此產(chǎn)生的微射流和沖擊波在細(xì)胞膜上形成可逆的非致死性小孔，使基因或藥物通過(guò)小孔進(jìn)入細(xì)胞，這種超聲的空化效應(yīng)和聲孔效應(yīng)理論是超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制；②超聲輻照微泡造影劑后產(chǎn)生的活性氧（H2O2）使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞膜通透性增加，且不影響細(xì)胞活性；③超聲聯(lián)合微泡輻照腫瘤組織區(qū)域產(chǎn)生熱效應(yīng)，細(xì)胞膜吸收和分散超聲能量，局部溫度短暫升高，影響磷脂雙層流動(dòng)性和細(xì)胞膜通透性[5,7]。

2 UTMD技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用

2.1 UTMD技術(shù)栓塞腫瘤微血管 腫瘤組織具有誘導(dǎo)新血管生成的能力，新血管不僅可以為腫瘤細(xì)胞提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以不斷地向宿主其他部位輸送腫瘤細(xì)胞，從而使惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[8]。抗腫瘤血管生成是繼手術(shù)、化療和放療等之后的一種新型腫瘤治療方法。介入治療主要針對(duì)管徑較大的腫瘤營(yíng)養(yǎng)血管，對(duì)小的滋養(yǎng)血管不能有效栓塞，而且對(duì)于多發(fā)、散在的腫瘤組織也難以手術(shù)或血管栓塞治療，現(xiàn)有方法多通過(guò)藥物攻擊腫瘤新生血管的特異性靶點(diǎn)，抑制血管增生，不良反應(yīng)較多，治療效果不甚理想[9]。

腫瘤組織中的新生血管與正常組織成熟血管比較，在結(jié)構(gòu)和功能上均有明顯差異。①包繞腫瘤血管的基底膜明顯減少，腫瘤血管通透性明顯升高；②腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分化程度較差，缺乏成熟的內(nèi)皮細(xì)胞；③腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞多處于細(xì)胞增殖期，更新速度是正常成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的20倍；④腫瘤組織血管壁缺乏神經(jīng)和肌肉成分，不能對(duì)血管活性物質(zhì)產(chǎn)生相應(yīng)的影響[10,11]。

UTMD技術(shù)可以直接作用于供應(yīng)腫瘤組織的營(yíng)養(yǎng)血管網(wǎng)，通過(guò)破損癌組織的微血管壁，激活內(nèi)源或外源性凝血機(jī)制，誘發(fā)大面積腫瘤組織新生血管的血栓形成，從而切斷作用區(qū)域內(nèi)腫瘤血液的供應(yīng)途徑，使腫瘤壞死[12]。為了增加栓塞血管效果，可以將凝血酶原類(lèi)、抗血管生成類(lèi)藥物與微泡進(jìn)行融合，或?qū)⑵湔先胛⑴?，使其在靶組織內(nèi)釋放，進(jìn)而達(dá)到更好的栓塞效果。近年來(lái)利用此技術(shù)誘導(dǎo)微血管栓塞治療實(shí)體腫瘤的研究越來(lái)越多，為腫瘤治療提供了新的治療思路[13]。

吳巍等[14]使用頻率為20 kHz、輸出功率為0.5 W的超聲治療儀聯(lián)合自制的CO2微泡對(duì)實(shí)體腫瘤進(jìn)行輻照，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤組織微血管具有較好的栓塞效果。鐘渝等[15]使用自制的新型超聲空化治療儀聯(lián)合注射劑量為0.2 ml/kg的脂氟顯微泡輻照大鼠皮下移植瘤3 min，發(fā)現(xiàn)新型超聲空化治療技術(shù)能夠毀損大鼠Walker-256腫瘤的微血管、阻斷其微循環(huán)，可能成為一種新型的物理抗腫瘤血管生成方法。王宇等[16]使用頻率為20 kHz，輻照強(qiáng)度為200 mW/cm2的超聲聯(lián)合0.2 ml微泡造影劑有效抑制了前列腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，電子顯微鏡下超聲微泡組腫瘤內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，線粒體腫大，基底膜斷裂；同時(shí)其內(nèi)的CD34陽(yáng)性染色微血管數(shù)減少，提示其抑瘤機(jī)制可能是通過(guò)超聲空化效應(yīng)破壞腫瘤的微血管實(shí)現(xiàn)的。此外，超聲微泡造影劑可以使其所攜帶的血管生成調(diào)節(jié)因子在靶組織中定向釋放，更好地控制腫瘤血管的生長(zhǎng)。Emoto等[17]利用UTMD技術(shù)使微泡攜帶血管生成抑制劑煙曲霉素的衍生物，對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行靶向釋放，增強(qiáng)了抑制腫瘤血管化的效果?？稻甑萚18]使用超聲靶向破壞載有紫杉醇的微泡，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織血管密度、CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平均明顯降低，其抗腫瘤效果明顯增強(qiáng)。Duvshani-Eshet等[19]利用UTMD技術(shù)將血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抑制劑注入前列腺癌細(xì)胞內(nèi)輻照20 min，明顯抑制了癌細(xì)胞的擴(kuò)增并誘導(dǎo)了其凋亡。

2.2 UTMD技術(shù)提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物治療效果 臨床腫瘤化療時(shí)常規(guī)給藥途徑主要包括口服和靜脈注射，血液中的藥物需克服血管內(nèi)皮屏障，穿過(guò)腫瘤組織間隙和腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)入腫瘤細(xì)胞才能發(fā)揮相應(yīng)的抗癌效果。為使化療藥物在腫瘤靶區(qū)達(dá)到有效濃度必須增大給藥劑量，這可能破壞正常組織和細(xì)胞，進(jìn)而造成全身毒副作用，同時(shí)基因或肽類(lèi)等大分子物質(zhì)較難進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的治療效果[20]。UTMD技術(shù)可以通過(guò)增加血管及細(xì)胞膜通透性，輔助多種治療藥物進(jìn)入細(xì)胞，提高細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，減少用藥劑量及毒副作用。

微泡造影劑是一種新型載體，UTMD技術(shù)可以使其攜帶的藥物定位釋放，達(dá)到靶向治療的目的。目前已知微泡與藥物的結(jié)合的方式有：①靜電吸附在微泡外殼，但其在血液循環(huán)中極不穩(wěn)定，藥物容易脫落；②包裹進(jìn)入微泡內(nèi)，這種藥物結(jié)合方式相對(duì)比較穩(wěn)定，且載藥率和包封率相對(duì)較高；③以非共價(jià)方式與微泡外殼相結(jié)合，如生物素-親和素系統(tǒng)等。藥物體內(nèi)定位釋放技術(shù)不僅可以顯著降低藥物用量，減輕藥物的毒副作用，而且可以提高病灶區(qū)域的藥物濃度，延緩藥物釋放、減少給藥次數(shù)，從而增強(qiáng)治療效果[21-23]。

Li等[24]使用UTMD技術(shù)破壞攜帶羥基喜樹(shù)堿的超聲微泡，對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下腫瘤進(jìn)行靶向輻照，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組明顯觀察到藥物在腫瘤部位聚集；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)腫瘤組織的抑制率分別為70.6%和47.8%。董虹美等[25]使用低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)米托蒽醌作用于MCF27乳腺癌細(xì)胞作用進(jìn)行觀察，透射電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞凋亡明顯，細(xì)胞膜通透性增加，藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部明顯增加。Kang等[26]發(fā)現(xiàn)UTMD技術(shù)聯(lián)合載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡能夠明顯抑制兔VX2皮下移植肝癌微血管的生成，進(jìn)而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，實(shí)驗(yàn)組兔存活時(shí)間較對(duì)照組延長(zhǎng)。Aryal等[27]使用聚焦超聲聯(lián)合多柔比星脂質(zhì)體微泡對(duì)大鼠膠質(zhì)瘤進(jìn)行靶向輻照，發(fā)現(xiàn)其能夠打開(kāi)血-腫瘤屏障和血-腦屏障，提高局部腫瘤組織藥物濃度，減輕毒副作用。Zhao等[28]觀察超聲定位輻照脂質(zhì)微泡聯(lián)合阿霉素對(duì)裸鼠白血病移植瘤的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)超聲定位輻照脂質(zhì)微泡可以有效地增強(qiáng)阿霉素的療效，具有較強(qiáng)的體內(nèi)抑瘤效果。Sorace等[29]將Def i nity微泡及紫杉醇經(jīng)鼠尾靜脈注射裸鼠體內(nèi)后，給予超聲輻照乳腺癌移植瘤體，發(fā)現(xiàn)超聲輻照聯(lián)合微泡可以增強(qiáng)化療藥物的藥理作用，抑制瘤體生長(zhǎng)。Xing等[30]使用卵巢癌SKOV3細(xì)胞懸液建立裸鼠皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)超聲靶向破壞載紫杉醇微泡對(duì)腫瘤組織進(jìn)行輻照，能夠顯著下調(diào)腫瘤血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及抑癌基因的表達(dá)水平。

2.3 UTMD技術(shù)增加治療基因的抑瘤效果 腫瘤組織的基因治療是指運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)把正?；蚧蛑亟M治療基因?qū)氘惓Ｄ[瘤細(xì)胞，以抑制致病基因表達(dá)或修復(fù)缺陷基因表達(dá)，使基因表達(dá)產(chǎn)物起到治療作用。治療基因要成功轉(zhuǎn)導(dǎo)需依次克服3個(gè)障礙：細(xì)胞外傳輸、細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)傳輸。病毒載體通過(guò)與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，可以逃避細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解，克服細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi)傳輸2個(gè)障礙，基因轉(zhuǎn)染效率高，但由于病毒的免疫原性和致突變性，使其安全性低、可控性差；相反，非病毒載體（如脂質(zhì)體）安全、可控，但不能有效地克服上述3個(gè)障礙，基因轉(zhuǎn)染率較低。此外，病毒及非病毒載體均不能很好解決靶向傳輸問(wèn)題，常規(guī)局部注射或灌注等方法，不僅有創(chuàng)，存在操作風(fēng)險(xiǎn)，而且不能實(shí)現(xiàn)均勻轉(zhuǎn)染[31,32]。

UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的有效方法[3]，超聲微泡作為一種靶向治療載體，破壞后釋放的基因能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、血管壁，甚至組織間隙，增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染表達(dá)，從而發(fā)揮靶向性治療作用[33]。Li等[34]發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡技術(shù)對(duì)自殺基因KDRP-CD/TK治療乳腺癌細(xì)胞具有明顯的促進(jìn)作用。Zhou等[35]采用UTMD技術(shù)將單純皰疹病毒胸腺激酶（HSV-TK）自殺基因與脂質(zhì)微泡混合制成載HSV-TK基因微泡，注入肝癌模型小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)TK蛋白表達(dá)顯著增加，腫瘤抑制效應(yīng)顯著，小鼠存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，證明超聲靶向微泡破壞可以有效轉(zhuǎn)染HSV-TK基因進(jìn)入靶組織，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Duvshani-Eshet等[36]應(yīng)用超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)pPEX基因靶向作用前列腺癌組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純應(yīng)用超聲輻照轉(zhuǎn)染pPEX基因的前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制率為35%，超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)pPEX基因的前列腺癌細(xì)胞抑制率為50%，而重復(fù)應(yīng)用超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)pPEX基因的前列腺癌細(xì)胞抑制率為80%，同時(shí)未對(duì)周?chē)M織造成損傷，這說(shuō)明超聲聯(lián)合微泡是一種新型非病毒轉(zhuǎn)染的、安全有效的基因治療方法。

3 UTMD技術(shù)的問(wèn)題與展望

UTMD具有無(wú)創(chuàng)、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，能夠明顯增加腫瘤的治療效果。但目前相關(guān)研究基本停留在細(xì)胞和小型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，尚缺乏應(yīng)用于大型動(dòng)物模型的相關(guān)報(bào)道，此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)入臨床應(yīng)用前仍存在很多問(wèn)題有待深入研究：①腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程復(fù)雜，機(jī)制尚不明確。目前廣泛應(yīng)用的異種基因移植模型個(gè)體之間存在差異和變異，不同腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度也各不相同，微泡荷載的不同化療藥物或基因是否對(duì)所有腫瘤均有效果尚待確認(rèn)[37]；②超聲儀器設(shè)備、參數(shù)、作用方式、藥物與微泡的結(jié)合方式及實(shí)驗(yàn)對(duì)象均不相同，這些均會(huì)影響藥物的傳輸效率，對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化尚未形成共識(shí)；③微泡載藥量較低，在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性差，需要改進(jìn)微泡的化學(xué)組成制作工藝及其攜帶藥物方式；④超聲破壞微泡可能對(duì)周?chē)M織造成一定的損傷，要將這一技術(shù)應(yīng)用于臨床，還要對(duì)微泡劑量、濃度和超聲輻照參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使其盡量與診斷超聲的條件相一致，提高對(duì)人體的安全性。盡管當(dāng)前的研究存在諸多難題，但隨著超聲技術(shù)和分子生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，以及微泡造影劑的研制進(jìn)展，超聲聯(lián)合微泡技術(shù)在腫瘤治療中必將具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

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