大鼠顳葉癲癇點燃后海馬zif268mRNA及其蛋白的時空表達變化

李春女， 李 淞， 李秀杰， 張淑琴， 梁建民

致癲過程包括分子、細胞和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的級聯(lián)變化［1］:神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)早期急性損害在最初數(shù)分鐘至數(shù)天出現(xiàn)，包括神經(jīng)細胞膜除極引起的離子通道動力學快速變化、功能蛋白的翻譯后修飾和即早基因(immediate early gene，IEGs)活化;在數(shù)小時至數(shù)周出現(xiàn)的亞急性反應包括轉(zhuǎn)錄事件、神經(jīng)元死亡和炎癥級聯(lián)反應;在數(shù)周至數(shù)月出現(xiàn)的慢性反應主要包括解剖學改變:如神經(jīng)發(fā)生、苔蘚纖維發(fā)芽、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和膠質(zhì)增生。IEGs編碼蛋白作為神經(jīng)細胞表面受體、胞質(zhì)第二信使系統(tǒng)和核內(nèi)特異靶基因間胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的第三信使，可作為轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)或下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應基因表達。因此，IEGs被喻為神經(jīng)元短期興奮性轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期癲癇表型的分子開關(guān)［2］，此外，IEGs也是癲癇后神經(jīng)元凋亡的重要調(diào)控因子之一［3］。zif268(也稱為 Egr-1、NGFI-A 或Krox 24)由Milbrandt于1987年首先克隆發(fā)現(xiàn)的一種IEGs［4］。zif268與長期記憶、空間記憶能力的鞏固密切相關(guān)［5］，可能是調(diào)節(jié)記憶相關(guān)蛋白合成的關(guān)鍵因子，也可能參與癲癇病理過程［6，7］。我們過去發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇大鼠存在空間記憶損害［8］，本研究探討海馬zif268時空表達與顳葉癲癇腦損傷的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠83只，體重約250g，月齡約2.5月，購于本校實驗動物部。試劑:KA和DEPC(美國Sigma公司)、多聚甲醛(北京化學試劑公司)、zif268mRNA原位雜交試劑盒和Zif268免疫組織化學試劑盒(美國 Santa cruz公司)。儀器:立體定位儀(美國)、HPIAS-1000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(日本)。

1.2 動物分組 Wistar大鼠83只，麻醉死亡2只，點燃后抽搐死亡3只，最終參與實驗78只，包括正常組6只，Sham組和TLE組各36只。后兩組按點燃或假手術(shù)后 6h、24h、72h、7d、14d、21d 時間點分為6小組，每小組6只。

1.3 顳葉癲癇模型建立 按以往方法［8］，在立體定位儀下，采用KA杏仁核微量注射方法建立大鼠顳葉癲癇點燃模型。按Racine分級標準將大鼠癲癇發(fā)作分為0～Ⅴ級［9］，大鼠出現(xiàn)Ⅳ級或以上發(fā)作者為點燃成功。假手術(shù)組杏仁核注射與KA等體積的PBS緩沖液。

1.4 石蠟切片標本制備 分別于點燃或假手術(shù)后6h、24h、72h 和 7d、14d、21d 再次麻醉大鼠，經(jīng)4%多聚甲醛液心臟灌注固定后取腦，以視交叉后4mm和8mm處行冠狀切片，片厚4mm，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成5μm厚連續(xù)冠狀切片。

1.5 原位雜交檢測 原位雜交過程按zif268mRNA原位雜交試劑盒說明書操作:主要步驟為切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，復合消化液暴露mRNA片段，預雜交，雜交，切片，IgG封閉和阻斷，滴加生物素化抗地高辛抗體;滴加高敏TSP(ZYMED)SABC過氧化物酶復合物，DAB劑顯色，蘇木素復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后光鏡觀察，陽性表達細胞被染成棕黃色。

1.6 免疫組織化學檢測 Zif268蛋白表達采用免疫組織化學ABC法，用生物素標記的第二抗體與鏈霉親和素蛋白連接的過氧化酶及基質(zhì)混合液的反應來測定細胞中的抗原，按試劑盒說明進行:包括切片脫蠟、二甲苯和梯度乙醇處理后用0.01%曲拉通X-100溶液浸泡，用3%H2O2處理，正常山羊血清封閉后，滴加特異性第一抗體，37℃濕盒孵育2h，內(nèi)源性生物素封閉和阻斷，滴加特異性生物素化第二抗體，37℃濕盒孵育50min，DAB顯色5min，蘇木素復染，封片，光鏡觀察。每次染色均以PBS代替第一抗體作為陰性對照。

1.7 圖像分析和統(tǒng)計學處理 在200倍放大顯微鏡下，zif268mRNA表達主要在神經(jīng)元胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒物質(zhì)，Zif268蛋白表達主要在神經(jīng)元胞核顯棕色。在每只大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)隨機各選擇5個不重疊視野，雙盲法統(tǒng)計zif268mRNA或Zif268蛋白表達陽性細胞數(shù)的均值分別記為每只大鼠海馬相應區(qū)域zif268mRNA或Zif268蛋白的表達量，結(jié)果以均數(shù)±標準差(χ±s)表示，記錄后繪制統(tǒng)計圖。應用SPSS 13.0軟件單因素方差分析和Logistic回歸分析進行數(shù)據(jù)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學觀察 KA注射后平均50min左右大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，最初表現(xiàn)為凝視、顫動、點頭等部分性發(fā)作動作，隨后出現(xiàn)Racine IV級或以上發(fā)作，以前肢痙攣旋轉(zhuǎn)、站立傾倒和四肢抽搐等為主，部分出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)。假手術(shù)組未見癲癇發(fā)作。

2.2 點燃成功率 參與點燃大鼠共41只，麻醉死亡2只，抽搐出現(xiàn)呼吸抑制死亡3只，點燃成功率為87.8%。假手術(shù)組36只無死亡者。

2.3 海馬各區(qū)或各時間點zif268mRNA表達

正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽性細胞表達率(positive cell count，PCC)無差異(P ＞0.05)，組內(nèi)比較均為 DG表達高于 CA1和 CA3區(qū)(P＜0.05)。TLE組海馬各區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，與正常組和Sham組不同，組內(nèi)不同區(qū)域表達無差異(P＞0.05);TLE組在點燃后24h海馬zif268mRNA出現(xiàn)表達高峰，7d最低，在14d和21d有所回升;點燃后6h、24h、14d、和 21d 高于 Sham 組(P ＜ 0.05);在21d海馬各區(qū)zif268mRNA表達均高于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬 zif268mRNA陽性細胞表達率與顳葉癲癇呈正相關(guān)(β=0.286，P＜0.001)。

2.4 海馬各區(qū)或各時間點Zif268蛋白表達正常組和Sham組海馬各區(qū)總體陽性細胞表達率無差異(P＞0.05)，組內(nèi)比較均以 DG表達高于CA1和CA3區(qū)(P＜0.05)，與 zif268mRNA表達一致。TLE組與zif268mRNA表達不一致，組內(nèi)比較，DG表達高于CA1區(qū)(P＜0.05)，與CA3區(qū)無差異(P＞0.05)，組間比較，DG表達低于 Sham組(P＜0.05);TLE組在點燃后6h海馬Zif268蛋白表達出現(xiàn)高峰，隨后降低，在14d升高，在21d再次降低;在點燃后24h和7d低于Sham組(P＜0.05)，在14d高于Sham組(P＜0.05);在21d海馬CA1和CA3區(qū)均高于Sham組(P＜0.05)，DG表達與與zif268mRNA表達不一致，低于Sham組(P＜0.05)。Logistic回歸分析顯示海馬Zif268蛋白陽性細胞表達率與顳葉癲癇呈負相關(guān)(β =-0.153，P ＜0.001)。

3 討論

與癲癇相關(guān)的神經(jīng)細胞基因表達變化分為早期反應和后期反應，早期反應基因為即早基因(IEGs)，通常編碼轉(zhuǎn)錄因子作為第三信使調(diào)節(jié)后期反應基因的表達，引起長期慢性表型改變，最終可能導致癲癇的產(chǎn)生和反復發(fā)作。研究表明，幾乎所有驚厥活動均可引起邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元IEGs動態(tài)表達變化，也包括非邊緣系統(tǒng)，如皮層、紋狀體和丘腦［1］，此外，許多IEGs參與調(diào)節(jié)癲癇后海馬神經(jīng)細胞的損傷與抗損傷過程［3］?？梢?，IEGs活化是致癲過程的重要環(huán)節(jié)之一［2］。

zif268是一種活性誘導依賴性表達的IEGs，是Egr家族成員，編碼82kDa或88kDa的Zif268蛋白，胞漿中的Zif268可被激活為轉(zhuǎn)錄因子ZIF268而移至胞核，ZIF268具有3個連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)，與調(diào)節(jié)序列 GCGC-TGGGCG結(jié)合，調(diào)控效應基因的轉(zhuǎn)錄［4］。目前認為突觸長時程增強效應(long term potentiation，LTP)構(gòu)成了學習記憶的生理基礎(chǔ)，Zif268蛋白是LTP維持階段的必須成分，Zif268缺陷則引起晚相LTP消失，24h后記憶喪失［10］。Zif268失活小鼠會出現(xiàn)記憶缺失［11］。最近的研究表明，Zif268是背側(cè)海馬記憶重現(xiàn)的再鞏固過程的必需要素［12］。因此，Zif268可能是調(diào)控記憶相關(guān)蛋白表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，Zif268不僅調(diào)節(jié)記憶功能，也參與癲癇后神經(jīng)元的病理損傷過程。戊四唑致癇大鼠海馬zif268mRNA表達增高［6］;電壓依賴型T型Ca(V)3.2通道與失神癲癇關(guān)系密切，Zif268可直接作用于Ca(V)3.2通道基因啟動子區(qū)，促進其轉(zhuǎn)錄［13］;Liang等在運動皮層注射破傷風毒素誘導的大鼠慢性局灶型癲癇，發(fā)現(xiàn)Zif268表達在注射點增高，在注射點周圍降低，推測Zif268可能對產(chǎn)生和維持局灶型癲癇起重要作用［7］。由于顳葉難治性癲癇Zif268相關(guān)報道極少，本研究采用KA杏仁核點燃成功建立了經(jīng)典的顳葉難治性癲癇大鼠模型［8］，并動態(tài)觀察了海馬 zif268mRNA及其蛋白的時空表達。

本研究表明，正常海馬各區(qū)zif268mRNA表達不完全一致，DG表達高于CA1和CA3區(qū)，Sham組與正常組海馬zif268mRNA區(qū)域分布無明顯差異，癲癇組海馬 CA1、CA3和DG區(qū)表達較Sham組增高。顳葉癲癇點燃后zif268mRNA表達的早期峰值、波動幅度和晚期表達均高于假手術(shù)組。Honkaniemi 等 報 道［14］，KA 點 燃 后 可 快 速 誘 導zif268mRNA在海馬、皮質(zhì)、杏仁核表達增高，多數(shù)腦區(qū)24h開始逐漸降低至基礎(chǔ)水平，但在CA1、CA3仍保持相對高水平，與本研究結(jié)果不完全一致。本研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇點燃后遠期海馬Zif268蛋白在海馬DG存在區(qū)域性表達降低，提示顳葉癲癇點燃后遠期海馬DG可能存在Zif268蛋白翻譯效率降低或蛋白穩(wěn)定性降低等蛋白合成紊亂現(xiàn)象，可能與神經(jīng)元死亡有關(guān)［14］。形態(tài)學資料已經(jīng)證實癲癇存在苔蘚纖維(mossy fiber，MF)發(fā)芽，并與癲癇的形成及其可塑性的建立密切相關(guān)。多數(shù)學者認為，CA3區(qū)神經(jīng)元丟失導致DG顆粒細胞與自身胞體產(chǎn)生回返性突觸聯(lián)系是MF發(fā)芽的主要機制。在本研究中，癲癇組21d海馬DG區(qū)zif268mRNA與其蛋白表達偏離，提示DG區(qū)可能存在較為長期的蛋白合成紊亂、較為嚴重的神經(jīng)元損傷和較少的神經(jīng)元再生，神經(jīng)修復機制可能被過度激活，可能是海馬MF發(fā)芽的病理基礎(chǔ)或反映?；貧w分析提示顳葉癲癇與海馬zif268mRNA表達呈正相關(guān)，與Zif268蛋白表達呈負相關(guān)，提示海馬即早基因zif268及其蛋白的時空表達變化可能參與KA點燃顳葉癲癇病理過程。

總之，顳葉癲癇的發(fā)病機制可能是一系列生物學事件級聯(lián)結(jié)果，其中IEGs表達是其中的重要環(huán)節(jié)之一。我們過去研究發(fā)現(xiàn)，顳葉癲癇大鼠存在空間記憶能力損害［8］，推測海馬zif268及其蛋白時空表達改變可能是顳葉癲癇記憶損害的途徑之一，還有待進一步研究。

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