新的腫瘤血供模式——血管生成擬態(tài)的研究現(xiàn)狀和意義

孫保存

腫瘤內(nèi)的血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)一方面保證腫瘤細(xì)胞的氧供、營養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的排泄以促進(jìn)腫瘤生長；另一方面，其管壁結(jié)構(gòu)不完整，基底膜厚薄不一，利于瘤細(xì)胞進(jìn)入管腔發(fā)生血道轉(zhuǎn)移［1］，因而在腫瘤的生長及侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。早在20世紀(jì)70年代，F(xiàn)olkman等［2］提出經(jīng)典的腫瘤血管生成理論：腫瘤生長首先經(jīng)歷無血管期，當(dāng)瘤體直徑大于2毫米時(shí)不能單純依賴彌散供氧，腫瘤細(xì)胞釋放多種血管生成因子，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，降解宿主毛細(xì)血管靜脈端的基底膜，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞迅速增殖并向腫瘤遷徙，逐步發(fā)育成為有功能的毛細(xì)血管袢，并與宿主血管相互吻合，構(gòu)成腫瘤的血液循環(huán)系統(tǒng)。然而，1999年，美國學(xué)者M(jìn)aniotis等［3］在對高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，即使直徑大于1 cm，腫瘤也極少發(fā)生壞死，普通病理切片上并未發(fā)現(xiàn)由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的新生血管，然而卻發(fā)現(xiàn)一些與脈絡(luò)膜血管相連的包含有紅細(xì)胞的PAS染色陽性的管道樣結(jié)構(gòu)，且這些管道樣結(jié)構(gòu)與血管造影圖存在一定的對應(yīng)關(guān)系，提示這些管道能形成功能性微循環(huán)。這是一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式，由于這種管道樣結(jié)構(gòu)不是發(fā)生于已存在的內(nèi)皮性血管而是從頭生成的，且模仿內(nèi)皮樣血管的形態(tài)和功能，故將其命名為血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）。VM概念的提出最初廣受爭議，許多研究者認(rèn)為VM并不是一種功能性的微循環(huán)管道，而是腫瘤組織內(nèi)出血和壞死造成的假象，不具備生物學(xué)意義［4-5］。然而在過去十幾年中，我們和其他一些學(xué)者通過活性炭示蹤、熒光染料及磁共振成像等技術(shù)手段均證實(shí)了由腫瘤細(xì)胞圍成VM管道與內(nèi)皮性血管相連通且其間存在流動的血漿和紅細(xì)胞，同時(shí)越來越多的研究證實(shí)在乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胃腸道間質(zhì)瘤、雙向分化腫瘤等多種腫瘤組織中都存在VM［6-14］，提示這一現(xiàn)象對于腫瘤可能有著普遍意義。

與經(jīng)典的腫瘤血管生成相比，VM管壁主要由基底膜圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞，VM管腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動。VM中紅細(xì)胞漏出和微血栓形成情況少見且VM周圍很少見到腫瘤壞死現(xiàn)象。大量研究結(jié)果表明VM多存在于高度惡性腫瘤組織中，有助于解釋某些惡性腫瘤高侵襲、高轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為。VM與宿主血管相連通有助于腫瘤血管網(wǎng)的構(gòu)建以維持腫瘤的快速生長；VM增加腫瘤細(xì)胞與血液接觸的機(jī)會，使腫瘤易于發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞與血流之間僅有一層PAS陽性的基底膜相隔，腫瘤細(xì)胞在釋放蛋白水解酶溶解基底膜后能直接進(jìn)入血流發(fā)生轉(zhuǎn)移，且參與形成VM的腫瘤細(xì)胞由于具有更高的可塑性和“干性”而影響化療與抗血管生成治療的療效，在乳腺癌、胃癌、腎透明細(xì)胞癌、肝癌、膽囊癌、腺泡橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌等[6,15-19]的研究中均發(fā)現(xiàn)VM與腫瘤血行轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及患者的生存期及預(yù)后密切相關(guān)。

為了明確這種特殊的腫瘤血供的形成機(jī)制，近十年來，諸多學(xué)者通過分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)方法進(jìn)行了多方面的探索。目前，VM發(fā)生機(jī)制的相關(guān)研究主要集中在腫瘤細(xì)胞去分化并向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、VM管道結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及促進(jìn)VM形成的腫瘤特定微環(huán)境等方面。

腫瘤細(xì)胞模擬其他類型細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為的特性被稱為“可塑性”，它是VM形成的分子基礎(chǔ)。Maniotis等在發(fā)現(xiàn)VM的同時(shí)注意到高侵襲性與低侵襲性的人黑色素瘤細(xì)胞在形成VM的能力上存在明顯差異，他們運(yùn)用cDNA微陣列分析了高、低侵襲性人黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)差異，顯示有210個(gè)差異基因表達(dá)，高侵襲性黑色素瘤能同時(shí)表達(dá)多種基因，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維母細(xì)胞等細(xì)胞表型的特異基因如VE-cadherin、Ephrin A2（EphA2）、組織因子途徑抑制因子（TFPI）、CD34、酪氨酸激酶受體1、神經(jīng)纖毛蛋白1,E-選擇素、CD105、層粘連蛋白5γ2（laminin5γ2）、纖維連接蛋白（fibronectin）、Ⅳ型膠原（collagenⅣ）及Ⅰ型膠原（collagenⅠ）等，其中約15個(gè)基因與內(nèi)皮/血管表型有關(guān)，而黑色素瘤細(xì)胞本身特異的分化標(biāo)記如Melan-A，微眼炎相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及酪氨酸激酶等表達(dá)顯著下調(diào)［3］。Hendrix等［20］發(fā)現(xiàn)高侵襲性黑色素瘤形成的VM管道樣結(jié)構(gòu)的過程與胚胎時(shí)期原始血管網(wǎng)的形成非常相似，且高表達(dá)血管內(nèi)皮鈣黏素（VE-cadherin）等與胚胎時(shí)期血管發(fā)育密切相關(guān)的基因。這些研究結(jié)果提示，在VM形成過程中，具有較強(qiáng)可塑性的腫瘤細(xì)胞就如同具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，選擇性地表達(dá)某些血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)基因，獲得血管內(nèi)皮細(xì)胞樣表型，“重演”了胚胎時(shí)期的血管形成過程，形成具有功能的微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)。

2010年，《自然》雜志同一期的兩篇文章報(bào)道了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的腫瘤干樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)腫瘤血管生成，提示腫瘤細(xì)胞“干樣特性”是VM形成的關(guān)鍵［21-22］。近年來，越來越多的研究表明經(jīng)歷上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的腫瘤細(xì)胞可具有一些干樣細(xì)胞的特性而更具惡性潛能［23-25］。另外，參與形成VM的腫瘤細(xì)胞模擬內(nèi)皮細(xì)胞的功能和表型，而內(nèi)皮細(xì)胞屬于間充質(zhì)細(xì)胞的一種，這些均提示EMT與VM具有密切關(guān)系，參與調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在VM形成過程中可能具有重要作用。沿著這一思路，我們在不同腫瘤組織中進(jìn)行了一系列的研究并取得了一些令人鼓舞的結(jié)果。在肝細(xì)胞性肝癌中，存在VM的組織中Twist1常高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中，增加Twist1的表達(dá)可顯著提高肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞形成VM管狀結(jié)構(gòu)的能力，而下調(diào)Twist1表達(dá)可降低其VM管狀結(jié)構(gòu)形成能力，進(jìn)一步闡明Twist1可能通過調(diào)控VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄和MMPs的活性參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞“塑形性”，促進(jìn)VM形成［17］。在結(jié)腸癌組織中，VM的存在與EMT重要轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達(dá)密切相關(guān)。通過小干擾RNA（siRNA）下調(diào)ZEB1表達(dá)不僅抑制結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT還可降低腫瘤細(xì)胞Flk-1和VE-cadherin的表達(dá)并影響其VM管樣結(jié)構(gòu)的形成［26］。在結(jié)腸癌中，Wnt/β-catenin信號通路活化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT并與VM形成密切相關(guān)，且Wnt/β-catenin信號通路抑制蛋白Dkk1可逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞EMT，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，增強(qiáng)細(xì)胞黏附能力，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞干樣細(xì)胞特性及干性標(biāo)記蛋白CD133、Lgr5和內(nèi)皮標(biāo)記蛋白VE-cadherin的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，影響VM形成。

除了腫瘤細(xì)胞的可塑性以外，細(xì)胞外基質(zhì)重塑也是VM形成的重要過程。Hess等［27-28］首先發(fā)現(xiàn)EphA2通過使FAK去磷酸化及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑促進(jìn)VM的形成，隨后的一些研究表明EPHA2、VE-cadherin、PI3K、FAK等蛋白分子組成的一系列信號級聯(lián)反應(yīng)在VM形成過程中起重要作用，EPHA2、VE-cadherin等上游分子通過樞紐型分子PI3K的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活下游分子MMP家族，促進(jìn)層黏連蛋白5 γ2鏈分裂并沉積于細(xì)胞外基質(zhì)，參與基質(zhì)重塑與VM形成［28-29］。

VM形成亦與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。缺氧環(huán)境可使包括高侵襲性黑素瘤細(xì)胞在內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞基因型發(fā)生改變，可塑性明顯提高，替代機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞行使構(gòu)筑腫瘤血管的功能。本實(shí)驗(yàn)組前期研究也發(fā)現(xiàn)，在缺氧微環(huán)境中，黑色素瘤細(xì)胞高表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-lα）誘導(dǎo)VM管道形成以獲得足夠供氧，而抑制HIF-lα表達(dá)可阻斷VM形成，提示缺氧可促進(jìn)VM形成且很可能是誘發(fā)VM形成的重要始動因素［28］。我們的研究發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中，局部缺氧和壓力變化可以上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生線形程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN），可能為腫瘤實(shí)質(zhì)中VM及新生血管的形成提供空間基礎(chǔ)［29-30］。

國內(nèi)外研究表明，cAMP、Galectin-3、Nodal、COX-2、Mig-7等也參與調(diào)控VM形成［31-36］。盡管目前對VM的相關(guān)研究已取得了較大進(jìn)展，但其形成機(jī)制尚未完全明確。

經(jīng)典的血管生成方式有血管生成和血管發(fā)生兩種，前者是指已經(jīng)存在的血管上的內(nèi)皮細(xì)胞以出芽的方式生成新的血管；后者是指由內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血管網(wǎng)。傳統(tǒng)的微血管計(jì)數(shù)只能反映腫瘤組織中內(nèi)皮依賴性血管的生長狀態(tài)而忽略了VM這種特殊的腫瘤血液微循環(huán)模式，并不能全面的評估血管生成對腫瘤患者的臨床意義和預(yù)后價(jià)值。VM的提出不僅改變了人們以往認(rèn)為的內(nèi)皮依賴性血管是腫瘤微循環(huán)唯一方式的傳統(tǒng)觀念，豐富了腫瘤血管生成理論，同時(shí)也有助于更深入闡明腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移機(jī)制，為腫瘤的預(yù)后判斷和治療提供了新的思路。

VM這一血供模式的存在表明腫瘤細(xì)胞能向胚胎樣的多能干細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，且VM分子機(jī)制的研究初步證實(shí)腫瘤細(xì)胞的“塑形性”即“干細(xì)胞樣特性”正是VM形成的關(guān)鍵。許多研究表明在VM形成過程中，腫瘤細(xì)胞可以通過胚胎樣基因的逆轉(zhuǎn)獲得間充質(zhì)細(xì)胞表型以模擬內(nèi)皮細(xì)胞的行為并構(gòu)成功能性微循環(huán)管道，而逆轉(zhuǎn)EMT可以顯著降低腫瘤細(xì)胞的“干性”和VM形成能力，這不僅使人們對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)性狀有了新的認(rèn)識，也極大地豐富了胚胎學(xué)、腫瘤干細(xì)胞理論。

貝伐單抗、內(nèi)皮抑素（恩度）等腫瘤血管靶向藥物在臨床上的普遍應(yīng)用表明抗血管生成治療已經(jīng)成為腫瘤治療的重要手段［37］。但也有不少研究發(fā)現(xiàn)某些患者使用抗血管生成治療效果不佳，甚至出現(xiàn)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的病例報(bào)告［38-40］。VM現(xiàn)象的存在某種程度上解釋了為何單純針對內(nèi)皮細(xì)胞的抗血管生成治療對某些患者并不能產(chǎn)生預(yù)期效果，提示我們在抗血管生成治療中需同時(shí)兼顧內(nèi)皮依賴性血管與VM才可能獲得良好療效。尋找調(diào)控VM的信號通路及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，篩選有效的針對VM的治療藥物對提高腫瘤治療效果有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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