內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路

劉 楠， 李 巖， 牛振華綜述， 于雪凡審校

細(xì)胞凋亡是一種相對(duì)有序的能量依賴的程序化死亡過程，廣泛存在于多細(xì)胞生物的各種器官和組織中。截止到目前，細(xì)胞凋亡通路主要有:死亡受體活化(外源性途徑)途徑、線粒體損傷途徑(內(nèi)源性途徑)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡途徑。前兩者是經(jīng)典凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，它由封閉的膜系統(tǒng)及其圍成的腔形成互相溝通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對(duì)細(xì)胞正常功能的維持至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在調(diào)節(jié)膜蛋白、分泌蛋白的折疊與加工、鈣的儲(chǔ)存與釋放方面具有重要的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)同時(shí)也是類固醇、膽固醇和脂質(zhì)的合成部位。研究表明，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有蛋白折疊或加工過程受阻、鈣離子穩(wěn)態(tài)被打破時(shí)，細(xì)胞將發(fā)生致死性的損害［1］。缺血/缺氧、鈣超載、氧化應(yīng)激等均可導(dǎo)致未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，從而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究證實(shí)，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙有關(guān)，包括缺血性腦卒中、阿爾茲海默病、帕金森病等。本文就內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路進(jìn)行如下綜述。

1 未折疊蛋白反應(yīng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞通過啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)特異信號(hào)系統(tǒng)抑制蛋白翻譯，促進(jìn)未折疊蛋白加工成熟和促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白降解，減輕ER蛋白負(fù)荷并促進(jìn)細(xì)胞重建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。能夠感知ER腔內(nèi)未折疊蛋白聚集的感受器主要是3個(gè)ER跨膜蛋白，即PERK(PKR-like ER kinase)、IRE1α(inositol requiting enzyme 1α)及 ATF6(activating transcription factor 6)。生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP(glucose-regulated protein 78/binding immunoglobulin protein)分別與PERK、IRE1α、ATF6暴露于ER腔中的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，處于非活化狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙時(shí)，未折疊蛋白大量聚集，GRP78便與PERK、IRE1α、ATF6解離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白結(jié)合，由此促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。PERK、IRE1α與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。PERK激活后特異性的磷酸化真核起始因子2的α亞單位(eIF2α)。磷酸化的eIF2α有抑制翻譯起始因子的功能，從而抑制大多數(shù)mRNA的翻譯、減少蛋白質(zhì)的合成。

IRE1α被自身磷酸化激活后具有核酸內(nèi)切酶活性，激活的IRE1α能從XBP-1 mRNA中特異性剪切26個(gè)堿基的內(nèi)含子，改變XBP-1 mRNA的開放閱讀框，其翻譯產(chǎn)物XBP-1能促進(jìn)含ERS反應(yīng)元件(endoplasmic reticulum stress responsive element，ERSE)的UPR靶分子如GRP78、GRP94表達(dá)，以減輕或中止ERS反應(yīng)，從而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究證實(shí)［2］，XBP-1是UPR重要的轉(zhuǎn)錄激活劑，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

與GRP78解離后，ATF6以囊泡轉(zhuǎn)移的方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體內(nèi)被絲氨酸蛋白酶S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)切割，產(chǎn)生游離的50kD的N端片段，并轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因的ERSE結(jié)合，包括GRP78、GRP94、ERp72、PDI和 CHOP，它們對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的恢復(fù)是必須的。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙時(shí)可通過UPR自我信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減弱ERS，減少未折疊蛋白的生成。然而，如果ERS嚴(yán)重且持續(xù)時(shí)間長，UPR最終會(huì)啟動(dòng)凋亡通路，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路

PERK、ATF6以及IRE-1α信號(hào)不僅能夠啟動(dòng)ERS的生存途徑，嚴(yán)重或長時(shí)間的ERS損傷了ER的功能時(shí)，這3個(gè)信號(hào)通路同樣能夠啟動(dòng)由ERS所介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而它們并不是直接引起細(xì)胞凋亡的，而是通過激活下游的凋亡信號(hào)分子，如CHOP/GADD153、JNK、caspase-12以及GSK-3/3β。研究表明，線粒體功能障礙也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡的重要促進(jìn)因子。

2.1 CHOP 通路 CHOP/GADD153(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，屬于C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員。CHOP含有一個(gè)N端轉(zhuǎn)錄激活域和C端的堿性鋅指(bZIP)結(jié)構(gòu)域。PERK、ATF6以及IRE1都能誘導(dǎo)CHOP的轉(zhuǎn)錄，其中PERK-eIF2α-ATF4是CHOP蛋白表達(dá)的主要途徑。如上所述，PERK與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。PERK激活后特異性的磷酸化eIF2α。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激無法挽救時(shí)，大量磷酸化的eIF2α使核糖體到達(dá)ATF4的開放閱讀框架允許ATF4的轉(zhuǎn)錄，ATF4進(jìn)入細(xì)胞核后便激活CHOP的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)［3］，PERK信號(hào)通路的激活可以減弱Aβ介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，說明PERK-eIF2α通路可以作為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茲海默病潛在的治療靶點(diǎn)。研究還發(fā)現(xiàn)［4］，對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞施行IRE1敲除后CHOP的表達(dá)下調(diào)，表明CHOP是經(jīng)IRE1激活的重要凋亡分子。

CHOP介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制總結(jié)如下:(1)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá):研究發(fā)現(xiàn)［5］，CHOP的過度表達(dá)造成Bcl-2的下調(diào)、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的耗竭、活性氧產(chǎn)物積增。(2)調(diào)節(jié)BIM和PUMA的誘導(dǎo):最近的一項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)在ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，ATF4-CHOP介導(dǎo)的Bcl-2家族成員PUMA的反式激活信號(hào)通路的存在。研究者發(fā)現(xiàn)ATF-4缺乏的神經(jīng)元表現(xiàn)出PUMA表達(dá)水平的明顯下調(diào)。此外，ATF4可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CHOP的表達(dá)，反過來CHOP可以激活PUMA的誘導(dǎo)。他們還證實(shí)了ERS時(shí)CHOP與PUMA啟動(dòng)子結(jié)合，并且當(dāng)CHOP被敲除時(shí)減弱了PUMA誘導(dǎo)和神經(jīng)元凋亡［6］。(3)上調(diào) DR5的表達(dá):DR5編碼細(xì)胞表面死亡受體，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。CHOP通過與DR5基因的5’旁側(cè)區(qū)結(jié)合來調(diào)節(jié)DR5的轉(zhuǎn)錄。人類神經(jīng)母細(xì)胞SHSY5Y細(xì)胞經(jīng)衣霉素誘導(dǎo)后，DR5表達(dá)明顯增加，這與CHOP的表達(dá)上調(diào)是一致的，并且兩者的上調(diào)均可被腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子抑制［7］。因此，DR5很可能是CHOP下游的凋亡因子。

2.2 JNK通路 JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPKKK)家族，JNK主要介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，因此又稱應(yīng)激激活蛋白激酶(SAPK)。短暫的JNK可以促進(jìn)細(xì)胞的生存，長期的JNK通路激活可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。ERS通過 IRE1α-TRAF2-ASK1通路和 MLK(mixed lineage kinases complex)復(fù)合體激活JNK通路。

如上所述，UPR時(shí)IRE1α與GRP78解離后發(fā)生二聚化和自身磷酸化，從而被激活。持續(xù)的IRE1α二聚化可導(dǎo)致凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ASK1)及其下游底物JNK的活化。JNK磷酸化既可以激活凋亡蛋白BIM，又可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2。研究發(fā)現(xiàn)［8］，ASK1的小分子調(diào)節(jié)劑可以保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，說明IRE1α-ASK1-JNK是一條重要凋亡信號(hào)通路。ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族的一員，可以激活 JNK和 p38信號(hào)通路［9］。Nishitoh H等人研究發(fā)現(xiàn)［10］，PC12細(xì)胞經(jīng)過毒胡蘿卜素(一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑，能夠引起UPR)或衣霉素(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)N-糖基化抑制劑)誘導(dǎo)后可以活化ASK1和JNK，表明ERS激活了ASK1-JNK通路。此外，ASK1與IRE1α只有在TRAF2(tumor necrosis factor receptor associated factor 2)和毒胡蘿卜素都存在的情況下才表現(xiàn)出相關(guān)性，這表明ERS誘導(dǎo)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜IRE1-TRAF2-ASK1復(fù)合體的形成，進(jìn)而激活了ASK1-JNK信號(hào)通路。以上說明ASK1在發(fā)生ERS時(shí)是主宰細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵因素。

MLK是一種通過磷酸化作用激活MAPK通路的絲/蘇氨酸蛋白激酶。目前為止，MLK已經(jīng)有7個(gè)家族成員被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)他們的催化亞基不同，又可以分為3個(gè)亞家族:MLKs、DLKs和 ZAKs。MLKs包括 MLK1、MLK2(MST)和 MLK3(SPRK/PTK)。MLK3，是分子量為93kD的一個(gè)成員，MLK3作為JNK級(jí)聯(lián)上游的重要活化因子，通過直接磷酸化并激活中游MKK4/7蛋白激酶，從而激活JNK應(yīng)激信號(hào)通路［11～13］。MLK3介導(dǎo)了JNK誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦缺血損傷通路，并因此受到重視。

2.3 caspase-12通路 caspase-12定位于ER外膜，是介導(dǎo)ERS凋亡的關(guān)鍵分子，在死亡受體或線粒體凋亡途徑中不被活化。caspase-12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡而其他死亡刺激仍可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，表明caspase-12與ERS介導(dǎo)凋亡的機(jī)制有關(guān)，而與非ERS介導(dǎo)的凋亡無關(guān)［14］。ERS時(shí)，以下信號(hào)通路可以激活caspase-12:(1)Ca2+依賴的calpain活化:calpain(鈣蛋白酶)是細(xì)胞質(zhì)中另一半胱氨酸蛋白酶家族成員，其活化依賴于Ca2+的存在。在ERS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高引起細(xì)胞質(zhì)calpain活化，剪切定位于ER膜上的procaspase-12，使之活化并釋放入細(xì)胞質(zhì)［15，16］。有證據(jù)表明，calpain的激活與很多疾病的形成有關(guān)，像缺血性腦損傷、阿爾茨海默病等。Nakagawa［15］研究發(fā)現(xiàn)，被剝奪氧和葡萄糖的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)引起calpain和caspase-12的激活。應(yīng)用calpain抑制劑后，caspase-12的切割被抑制，說明calpain激活了caspase-12。在皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中也得到了相同結(jié)果。(2)TRAF2依賴性機(jī)制:在HEK293T細(xì)胞中已經(jīng)證實(shí)，在非應(yīng)激狀態(tài)下，TRAF2與procaspase-12形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而ERS可導(dǎo)致procaspase-12與TRAF2分離，引起caspase-12活化，并同時(shí)引起JNK-IRE1復(fù)合物募集TRAF2，導(dǎo)致JNK磷酸化而活化［17］。神經(jīng)元蠟樣脂褐氏沉積病的CLN8(mnd)大鼠模型也證實(shí)了以上結(jié)果［18］。(3)caspase-7 ER轉(zhuǎn)位:ERS引起caspase-7移位至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，與caspase-12形成復(fù)合物并在Asp94和Asp341處切割procaspase-12，破壞了膜與 caspase-12的聯(lián)系，使之活化并釋放于細(xì)胞質(zhì)。caspase-12目前僅在鼠中得到克隆物，而人體中的caspase-12因?yàn)榛蛲蛔兌鴨适Я苏{(diào)控凋亡的作用，但可能是其同源異構(gòu)體caspase-4發(fā)揮相同作用。caspase-12的作用，目前的研究還不是很透徹。對(duì)caspase-12的了解，將對(duì)人類caspase-4的研究提供科學(xué)依據(jù)和借鑒。

2.4 GSK3/3β介導(dǎo)的凋亡通路 糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種在進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要有兩種亞型，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β高度表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)并具有神經(jīng)系統(tǒng)特異性。GSK-3β能作用于眾多信號(hào)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖、存活和凋亡。GSK-3β在細(xì)胞內(nèi)活性受雙位點(diǎn)磷酸化調(diào)控，在Tyr216磷酸化激活，在Tyr216去磷酸化或者在Ser9磷酸化而失活。研究已經(jīng)證實(shí)［19，20］，GSK-3β 與 ERS介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路相關(guān)，使用GSK-3抑制劑可以減弱ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但GSK-3確切的促凋亡機(jī)制目前尚不完全清楚。Meares GP等人研究發(fā)現(xiàn)［21］，給予GSK-3抑制劑鋰可以保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞及永生化大鼠海馬神經(jīng)元免受毒胡蘿卜素、衣霉素和布雷菲德菌素A誘導(dǎo)的ERS。GSK-3抑制劑也可以保護(hù)小腦顆粒神經(jīng)元免受布雷菲德菌素A誘導(dǎo)的ERS及其凋亡，保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞、PC12細(xì)胞、小腦顆粒神經(jīng)元免受6-羥多巴胺誘導(dǎo)的ERS及凋亡，保護(hù)PC12細(xì)胞免受毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的ERS及凋亡。目前GSK-3抑制劑可能的保護(hù)機(jī)制包括抑制Bax的活化，上調(diào)GRP78和bcl-2的表達(dá)、降低細(xì)胞內(nèi)鈣水平和降低CHOP的表達(dá)。

2.5 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與線粒體 近年來研究證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間存在串?dāng)_［22，23］。線粒體外膜是位于線粒體最外圍的一層單位膜，厚度約為6～7nm。高分辨三維X射線攝影可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體之間有20%的膜是緊密接觸的，在這些接觸位點(diǎn)上線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜通過某些蛋白質(zhì)相連，形成稱為“線粒體結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜”(mitochondria-associated ER-membrane，MAM)的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在脂質(zhì)的相互交換和線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)間的鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)等過程中都有重要作用。長時(shí)間過強(qiáng)的ERS導(dǎo)致Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)釋放到MAM，進(jìn)而引起線粒體基質(zhì)攝取過量Ca2+。Ca2+的過量攝入會(huì)擾亂線粒體內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)，持續(xù)的Ca2+聚積會(huì)導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)化孔(mtPTP)的開放，促進(jìn)CytC釋放，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游caspases-3，引發(fā)死亡蛋白酶caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，ERS時(shí)可激活線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，ERS是線粒體應(yīng)激發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)。

3 結(jié)論與展望

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)于細(xì)胞正常功能的維持是必不可少的。ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，包括腦缺血性卒中、阿爾茲海默病、帕金森病等，所以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有望成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新靶點(diǎn)。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)自我保護(hù)機(jī)制UPR的存在，提示人們基于這種分子機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)損傷的保護(hù)以及相關(guān)疾病的干預(yù)。Taurine(2-氨基乙磺酸)，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是廣泛存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的最多的游離氨基酸。近來，Gharibani等人的研究發(fā)現(xiàn)［24］，Taurine可以減弱低氧/復(fù)氧及缺血誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，作用機(jī)制是阻斷ATF6和IRE1通路活化，這在PC12細(xì)胞及大鼠MCAO模型中均得到證實(shí)。此外，基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路的相關(guān)分子可給予相應(yīng)抑制劑進(jìn)行阻斷。Parecoxib，一種新的COX-2抑制劑，可以作為神經(jīng)保護(hù)劑，挽救腦缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。近來，Ye Zhi等人發(fā)現(xiàn)［25］，Parecoxib可以顯著抑制缺血半暗帶CHOP的表達(dá)及caspase-12的免疫活性，進(jìn)而減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡?？傊瑑?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制及其相關(guān)保護(hù)方案仍有待進(jìn)一步研究，以幫助我們?nèi)娴纳顚哟蔚牧私鈨?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用，并為臨床疾病治療方案提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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